海南黎藥血葉蘭的無菌播種及高效繁育技術(shù)初探

陳耀麗，尤燕平，鐘云芳，吳文蝶，陳英轉(zhuǎn)，楊澤秀，2

1.熱帶特色林木遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué)林學(xué)院，海南?？?570228；

2.海南珠峰園林科技有限公司，海南?？?570220；

3.福建江南春城市建設(shè)集團(tuán)有限公司，福建漳州363005

血葉蘭（Ludisia disclor）是蘭科血葉蘭屬草本植物，在中國主要分布福建、廣東、廣西、海南、云南南部、貴州等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]，在大洋洲的納土納群島和東南亞的泰國、馬來西亞、越南等地區(qū)也有少量分布[2]。血葉蘭匍匐生長，喜歡陰涼濕潤的環(huán)境，生長于陰涼濕潤的巖石上，它的根狀莖暗紅色，粗壯肥厚、肉質(zhì)，具有比較明顯的莖節(jié)。葉片是倒卵形，暗紅色或暗紫色，具有清晰的葉脈網(wǎng)紋，具有較高的觀形觀葉價(jià)值[3]。血葉蘭具有味甘、性涼特性，其莖段和葉片用水煎服，可以滋陰潤肺，可以治療肺結(jié)核咳血、食欲不振[4]等癥狀，具有健脾安神的功效[5]，是海南傳統(tǒng)黎藥。在福建閩南地區(qū)，老百姓也推崇其藥用價(jià)值[6]，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)化，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)商品血葉蘭的模式不斷興起[7]。

血葉蘭種子由果莢包被，一個(gè)果莢含有上千粒種子，種子只有微小的胚，不含胚乳和子葉，在自然條件下種子自身缺乏養(yǎng)分，難以萌發(fā)和繁殖，通過組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行蘭科植物種子無菌播種，誘導(dǎo)種胚萌發(fā)成苗，已經(jīng)成為血葉蘭保育和繁殖的重要手段。近年來，由于血葉蘭的藥用價(jià)值不斷被挖掘出來，人為的干擾及破壞，導(dǎo)致血葉蘭野生資源瀕臨滅絕，國家已將血葉蘭列為二級保護(hù)植物。因此，研究野生血葉蘭的無菌播種及組織快繁技術(shù)，不僅可以有效的保護(hù)野生血葉蘭種質(zhì)資源，也為量化生產(chǎn)商品血葉蘭提供技術(shù)支持。

國內(nèi)外對血葉蘭的研究集中在開花物候及繁育[8]、內(nèi)生菌共生[9]，生物學(xué)性狀研究[10]，種質(zhì)資源保護(hù)[11]、人工引種馴化栽培[12]、有效成分分析[13]、藥用成分開發(fā)[14]，親緣關(guān)系分析[15-16]，組織培養(yǎng)[17-18]等方面。該研究在此基礎(chǔ)上，結(jié)合目前海南血葉蘭生產(chǎn)現(xiàn)狀，探索野生血葉蘭無菌播種和組織快速繁育技術(shù)，以期為推動海南血葉蘭產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

對生長在昌江霸王嶺自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的野生血葉蘭進(jìn)行人工授粉，花粉結(jié)實(shí)后，當(dāng)果莢生長成熟度達(dá)到85%，還沒有開裂時(shí)，將果莢采下后，用酒精進(jìn)行表面消毒保存，開展離體播種實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)誘導(dǎo)

采回來的血葉蘭果莢，用毛筆刷洗果莢表面后，在洗衣液中浸泡10min，然后無菌水搖晃沖洗干凈后，用脫脂棉吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到消毒殺菌的超凈工作臺上進(jìn)行播種。用75%的酒精浸泡血葉蘭果莢30s 后，用無菌水清洗兩遍，再用有效氯含量為0.8%的次氯酸鈉溶液消毒5min～8min，期間不斷搖晃瓶子，用無菌水沖洗5 遍～7 遍，風(fēng)干表面水分后。將果莢放置在經(jīng)高溫消毒的濾紙上，切開血葉蘭果莢，將種子均勻散播到到不同培養(yǎng)基中。該種子萌發(fā)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，使用花寶1 號、KC、1/2MS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加20g/L 的土豆和100mL 的椰汁等有機(jī)物，具體的培養(yǎng)基配方見表1。

表1 誘導(dǎo)血葉蘭種子萌發(fā)的添加土豆和椰汁的不同培養(yǎng)基Tab.1 Formulas of Ludisia discolor Seeding Medium with Potato and Coconut Juice

血葉蘭種子播種后，先暗培養(yǎng)7d，再將播種后的種子轉(zhuǎn)到25℃的培養(yǎng)室，培養(yǎng)的光強(qiáng)是1500lx～2000lx，每天的光照時(shí)間是12h～14h。培養(yǎng)60d 后，記錄血葉蘭種子萌動時(shí)間，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2 根狀莖分化誘導(dǎo)

血葉蘭種子萌發(fā)后，產(chǎn)生白色絮狀根毛和原球莖。將原球莖轉(zhuǎn)接到添加不同花寶種類的1/2MS 培養(yǎng)基中，每1L 培養(yǎng)基中均添加蔗糖20g、添加瓊脂7g/L、添加活性炭1g，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值為5.8～6.0。具體的培養(yǎng)基配方見表2，每個(gè)配方重復(fù)3 次，每次重復(fù)接種10 個(gè)，正常光照培養(yǎng)45d 后，統(tǒng)計(jì)血葉蘭根狀莖的誘導(dǎo)分化率。

表2 誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖分化的添加不同花寶的培養(yǎng)基Tab.2 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Induction Medium

1.2.3 血葉蘭根狀莖增殖培養(yǎng)

以1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中添加20g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂和1g/L 活性炭，激動素（KT）設(shè)置4 種不同濃度，分裂素（NAA）設(shè)置3 種不同濃度，設(shè)置12 組不同的激素配比，KT 和NAA 的濃度組合見表3。每個(gè)激素組合的配方接種10 瓶，每瓶接種5 個(gè)血葉蘭根狀莖，培養(yǎng)60d 后統(tǒng)計(jì)血葉蘭根狀莖叢芽增殖情況。

表3 添加不同激素的誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖叢芽增殖培養(yǎng)基Tab.3 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Proliferation Medium

1.2.4 壯苗生根培養(yǎng)

選擇已經(jīng)長出3 片葉子，長勢相對一致的血葉蘭無菌苗，探索不同濃度的吲哚丁酸(IBA)和不同濃度的萘乙酸(NAA)組合在一起對血葉蘭無菌苗長勢和生根的影響。IBA 和NAA 均設(shè)置3 個(gè)不同梯度濃度，以1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA 和NAA 等生長調(diào)節(jié)劑，兩種激素的濃度如表4 所示。每種生根培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接30 株血葉蘭增殖苗。經(jīng)過60d 的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)血葉蘭生根和株高情況。

表4 血葉蘭壯苗生根培養(yǎng)基添加的激素種類和濃度Tab.4 Additions of Ludisia discolor Strenthening Shoot and Rooting Medium

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)誘導(dǎo)

血葉蘭種子在所有處理組上都可以萌發(fā)，其種子萌發(fā)的時(shí)間和萌芽率結(jié)果有較大差異，種子萌發(fā)整齊度也不一致。血葉蘭種子萌動的時(shí)間、萌芽率和萌發(fā)生長狀態(tài)見表5。

表5 添加不同有機(jī)物的培養(yǎng)基對血葉蘭種子萌發(fā)的影響Tab.5 Results of Seed Germination on Different Medium

從表5 中可以看出，在萌發(fā)時(shí)間上，血葉蘭種子在添加了土豆的KC 培養(yǎng)基上萌動最快，時(shí)間最短，只有20d，萌動時(shí)間明顯短于其他培養(yǎng)基。在添加椰汁的1/2MS 的培養(yǎng)基中萌發(fā)最慢，萌發(fā)時(shí)間最長，為88d。在血葉蘭種子萌芽率方面，在KC 培養(yǎng)基添加土豆有機(jī)物能顯著促進(jìn)血葉蘭種子萌發(fā)，萌芽率為88.44%，顯著高于其他5 種培養(yǎng)基。而1/2 MS+椰汁的培養(yǎng)基對血葉蘭種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最小，只有11.66%，顯著低于其他培養(yǎng)基。

血葉蘭種子的萌發(fā)速度在添加土豆汁和椰子汁的實(shí)驗(yàn)處理中的萌發(fā)速度如下：KC+土豆＞花寶1號+土豆＞花寶1 號+椰汁＞KC+椰汁＞1/2 MS+土豆＞1/2 MS+椰汁的培養(yǎng)基。

血葉蘭在各培養(yǎng)基中的萌芽率是，KC+土豆＞KC+椰汁＞花寶1 號+土豆＞1/2 MS+土豆＞花寶1 號+椰汁＞1/2 MS+椰汁。

綜合血葉蘭種子在各培養(yǎng)基中的萌發(fā)速度和萌發(fā)率，優(yōu)選出在誘導(dǎo)血葉蘭種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是：KC+20g/L 土豆+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂+1.0g/L 活性炭。

圖1 血葉蘭種子萌動圖（A、B：種胚膨大；C、D、E：種胚變大，突破種皮，出現(xiàn)白色絮狀根毛；F：分化出分生組織）Fig.1 Ludisia discolor Seed Germinated (A-B：Seed Embryo Swell；C-E：Continued Embryo Enlargement,Testa Ruptured，Rhizoids Present；F：Appearance of Protomeristem)

2.2 1/2MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加不同型號的花寶對血葉蘭根狀莖分化的影響

從表6 中可以看出，添加不同花寶的1/2 MS 培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖分化，在不同培養(yǎng)基中，均能觀察到血葉蘭莖段表面長滿白色的根毛絮狀物（見圖2-A）。血葉蘭種子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d 后，發(fā)現(xiàn)所有處理組的根狀莖的頂端陸續(xù)分化出白色緊湊的芽點(diǎn)，說明所有添加花寶的處理均能使血葉蘭根狀莖分化發(fā)芽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖分化發(fā)芽方面，添加了花寶4 號的1/2MS 培養(yǎng)基對血葉蘭根狀莖影響最大，誘導(dǎo)率顯著高于其他添加花寶的處理組，為98.3%。在1/2MS 中添加不同花寶的培養(yǎng)基，對血葉蘭根狀莖分化的誘導(dǎo)率的先后順序是，1/2MS+花寶4 號＞1/2MS+花寶1 號＞1/2MS+花寶2 號＞1/2MS+花寶5 號＞1/2MS+花寶3 號。

圖2 血葉蘭根狀莖誘導(dǎo)發(fā)芽Fig.2 The Rhizome Bud Induction

表6 1/2MS 培養(yǎng)基添加不同花寶誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖分化情況Tab.6 Results of Rhizome Induction on Different Medium

在生長勢方面，血葉蘭在添加花寶4 號的1/2MS 培養(yǎng)基中的長勢最好，優(yōu)于其他培養(yǎng)基，其優(yōu)先順序?yàn)椋?/2MS+花寶4 號>1/2MS+花寶1 號=1/2MS+花寶2 號>1/2MS+花寶5 號=1/2MS+花寶3 號。

2.3 不同激素配比對血葉蘭根狀莖叢生芽增殖的影響

根據(jù)表7 可知，以1/2 MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的KT 和NAA，可以誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖叢生芽增殖，增殖苗的狀態(tài)較佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在KT 濃度分別固定在1.0mg/L 和3.0mg/L 時(shí)，當(dāng)NAA的濃度從0.1mg/L 逐漸遞增到0.5mg/L 時(shí)，血葉蘭的根狀莖叢生芽數(shù)量呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。當(dāng)NAA 的濃度在0.3mg/L 時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)到頂峰值。當(dāng)兩種激素的濃度是3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA 時(shí)，血葉蘭根狀莖誘導(dǎo)的叢生芽的數(shù)量最多，生長勢較佳。當(dāng)KT 的濃度為5.0mg/L 時(shí)，隨著NAA 濃度的增加，血葉蘭叢生芽增殖系數(shù)減少，但莖段之間的增殖倍數(shù)差異不顯著。

表7 血葉蘭叢生芽不同激素種類和濃度的培養(yǎng)基誘導(dǎo)增殖情況Tab.7 Results of 1/2MS with Different Hormones to induce Ludisia Discolor Multipropagation

當(dāng)NAA 濃度是0.1mg/L 和0.5mg/L 時(shí)，血葉蘭的叢芽數(shù)量隨著KT 濃度的增加而增加，但差異并不顯著。當(dāng)NAA 是0.3mg/L 時(shí)，隨著KT 濃度的增加，血葉蘭的根狀莖叢芽增殖系數(shù)先增加，然后減少，且顯著較差異，說明KT 的濃度對血葉蘭根狀莖叢生芽增殖誘導(dǎo)影響比較大。

圖3 血葉蘭根狀莖叢生芽誘導(dǎo)增殖Fig.3 The Rhizome Bud Micropropagation

2.4 不同激素的培養(yǎng)基對血葉蘭壯苗生根的影響

將有3 片真葉的血葉蘭無菌苗接種在同時(shí)添加不同濃度的IBA 和NAA 的1/2MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d 后，血葉蘭無菌苗根狀莖基部開始萌動突起，出現(xiàn)乳白色的根毛，且逐漸長出新葉。培養(yǎng)45d 左右，血葉蘭葉片展開長大，根莖粗壯，根毛茂盛，60d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量。

圖4 血葉蘭無菌苗壯苗生根Fig.4 Shoots Strengthening and Roots Induction of Ludisai Discolor

從表8 中可以看出，IBA 和NAA 組合在一起時(shí)，能夠促進(jìn)血葉蘭壯苗和生根。當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，將IBA 濃度由0.1 mg/L 增加到0.5 mg/L 時(shí)，血葉蘭的株高隨著IBA 濃度的增加而明顯升高，當(dāng)IBA 濃度由0.5 mg/L 增加到1.0 mg/L 時(shí)，血葉蘭的株高隨著IBA 濃度的增加而逐漸減少，說明當(dāng)IBA 的濃度小于等于0.5 mg/L，IBA 能促進(jìn)血葉蘭的生長，而IBA 濃度≥0.5 mg/L，血葉蘭的生長狀態(tài)隨著IBA濃度的增加而減弱，說明高濃度的IBA 和低濃度的NAA 混合配比時(shí)，能使血葉蘭的生長和生根得到抑制。因此，血葉蘭最適的生長和生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+5%香蕉+20g/L蔗糖+7g/L 瓊脂。

表8 1/2MS 培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA 和NAA 對血葉蘭壯苗生根的影響Tab.8 Resules of Different Medium inducting Ludisia discolor Rooting

3 討論

有很多種培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)血葉蘭種子離體萌發(fā)，如VW、KC、花寶系列、1/2MS 和MS 培養(yǎng)基等。該研究中比較了添加土豆和椰汁的KC、1/2MS、花寶1號等三種不同的培養(yǎng)基對血葉蘭種子萌發(fā)的影響。研究表明，血葉蘭在添加了土豆KC 培養(yǎng)基上萌發(fā)最快，添加土豆的花寶1 號次之，添加土豆的1/2MS培養(yǎng)基萌發(fā)最慢。而李宏楊[18]的研究結(jié)果顯示，血葉蘭種子在1/2MS 和花寶1 號萌發(fā)時(shí)間差不多。出現(xiàn)差異的原因有可能是，在該研究中，筆者在1/2MS 和花寶1 號培養(yǎng)基中添加了土豆和椰汁等有機(jī)物質(zhì)，有機(jī)物與基本培養(yǎng)基的相互作用影響了種子養(yǎng)分的吸收[19]。另外，血葉蘭種子的萌發(fā)也會受到種子來源、種子活力、培養(yǎng)溫度、光照、濕度等條件的影響。在開展研究工作時(shí)，需要嘗試幾種不同的培養(yǎng)基，才能選擇出合適的誘導(dǎo)血葉蘭種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。廖紅英、劉雅舒、高壯壯等通過在培養(yǎng)基中添加花寶1號和花寶2 號，成功誘導(dǎo)德氏兜蘭的原球莖和蝴蝶蘭不定芽增殖分化[20-21]，誘導(dǎo)墨蘭根狀莖的分化及生長[22]，這與該研究中不同的花寶種類成功誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖分化的結(jié)果一致，而在研究中，以花寶4號對血葉蘭根狀莖分化誘導(dǎo)率最高，且長勢最好，這可能與花寶4 號的N、P、K 比例有關(guān)，較適宜促進(jìn)根狀莖新芽和根的分化有關(guān)。

血葉蘭在不同的根狀莖分化、叢芽增殖培養(yǎng)等生長階段需要不同的種類和不同濃度的激素。蘇建睦[20]在研究6BA，NAA，TDZ 等三種激素對血葉蘭叢芽增殖的研究中發(fā)現(xiàn)，在MS 培養(yǎng)基中添加高濃度的6-BA 和低濃度的NAA、TDZ 時(shí)，可以促進(jìn)血葉蘭根狀莖叢芽增殖，增殖系數(shù)達(dá)到4.92。朱橋的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[23]，最適宜血葉蘭根狀莖叢生芽增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+15%香蕉汁，叢芽增殖系數(shù)達(dá)到4.83。在該研究中，篩選出最適宜誘導(dǎo)血葉蘭根狀莖叢芽生長的培養(yǎng)基是1/2MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA+20g/L 蔗糖+1g/L 活性炭+7g/L 瓊脂，叢芽長勢較好，增殖系數(shù)達(dá)到5.05。這與王高鵬使用1.5mg/L KT+0.5mg/L NAA 誘導(dǎo)白芨增殖的方法相似[24]。

植物生長調(diào)節(jié)劑IBA、NAA 對壯苗生根起到重要作用，蘇建睦的研究結(jié)果表明，最適宜血葉蘭壯苗生根的培養(yǎng)基是0.5mg/L NAA+1.6mg/IBA+15%香蕉，生根率達(dá)到93.0%[17]。在血葉蘭壯苗生根實(shí)驗(yàn)中，使用適宜濃度的IBA 和NAA，同時(shí)配合使用有機(jī)添加物香蕉，植株生長旺盛，可以大幅提高生根率，生根效果好。該研究表明，在血葉蘭無菌苗壯苗生根時(shí)，使用1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+50g/L 香蕉+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂的配方，能夠顯著促進(jìn)血葉蘭生長、生根和苗的質(zhì)量，生根率達(dá)到100%。