甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M1的研究進(jìn)展

孫藝學(xué)，叢彥龍

(1.長春大學(xué) 吉林省生物醫(yī)學(xué)工程研發(fā)中心，吉林 長春 130022；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)屬于正黏病毒科、α流感病毒屬，是感染各種鳥類和多種哺乳動(dòng)物的病原體。IAV基因組由8條分節(jié)段的、單股負(fù)鏈RNA組成，編碼至少17種蛋白[1]。其中，基質(zhì)蛋白1(matrix protein 1，M1)是IAV第7基因節(jié)段所編碼、294個(gè)氨基酸組成，且是病毒粒子內(nèi)含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒蛋白總量的40%[2]。每個(gè)病毒粒子約含有3 000個(gè)M1分子[3]，緊挨在病毒囊膜下層形成一層基質(zhì)。但M1并不是孤立存在的，其向外與IAV的兩種跨膜纖突蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)合[4]，向內(nèi)與病毒的8個(gè)核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein，vRNP)互作[5]。M1不僅保持了病毒粒子的完整性，維持并調(diào)節(jié)病毒粒子的形態(tài)，而且在病毒生命周期的不同階段發(fā)揮著多種功能[6-7]。

1 M1的結(jié)構(gòu)

在負(fù)染電鏡下，M1是長約60?的桿狀物，其與病毒囊膜接觸，但沒有嵌入膜內(nèi)[8]。高分辨率冷凍電子斷層掃描顯微鏡顯示，M1為空心圓柱體，類似一串螺旋盤升的“珠子”[9]。X射線分析顯示，約90%的M1的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋組成，具體包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即由4個(gè)α-螺旋(H1～H4)構(gòu)成的氨基端結(jié)構(gòu)域(殘基1～66)，由4個(gè)α-螺旋(H6～H9)構(gòu)成的中間結(jié)構(gòu)域(殘基88～158)，以及預(yù)測(cè)的同樣由4個(gè)α-螺旋(H10～H13)構(gòu)成的羧基端結(jié)構(gòu)域(殘基167～252)。其中，氨基端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域位于M1的N-末端，二者由L4-H5-L5連接，即所謂的“連接區(qū)”(殘基67～87)[2]。中間結(jié)構(gòu)域和位于C-末端的羧基端結(jié)構(gòu)域由一個(gè)環(huán)區(qū)L9(殘基162～166)連接，其間保守的163RQMV166基序具有Q-M裂解位點(diǎn)[10]。

2 M1在IAV復(fù)制周期中的功能

M1合成于IAV感染的晚期，在病毒生命周期中的脫殼、vRNP出核、病毒組裝和出芽等多個(gè)階段均發(fā)揮作用。

2.1 介導(dǎo)vRNP的釋放IAV進(jìn)入細(xì)胞后需要將vRNP釋放到細(xì)胞質(zhì)以開啟病毒的復(fù)制周期，而拆除基質(zhì)層M1的骨架結(jié)構(gòu)(即病毒的脫殼)是vRNP釋放的前提條件。三維結(jié)構(gòu)分析表明，IAV的8段vRNP的排列方式是基于M1骨架結(jié)構(gòu)的支撐[11]，但這種支撐作用在病毒復(fù)制周期中的不同階段時(shí)有時(shí)無。在pH6.0左右時(shí)，基質(zhì)層的構(gòu)象開始發(fā)生變化，使M1與vRNP的互作弱化，導(dǎo)致病毒粒子的剛性喪失[12]，此時(shí)是病毒脫殼的啟動(dòng)階段。當(dāng)pH值下降至4.9時(shí)，M1骨架解體，不再靠近病毒囊膜，此時(shí)vRNP出現(xiàn)非對(duì)稱性定位，M1與vRNP形成一個(gè)聚集體，并促使vRNP進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[9]。由此可見，M1與vRNP的互作與pH的改變有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在pH 6.5～7.0和5.0～5.5時(shí)，M1的電荷數(shù)明顯不同，由此導(dǎo)致病毒的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[13]。

2.2 介導(dǎo)新組裝的vRNP出核研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)M1的合成受阻時(shí)，vRNP的出核將受到抑制[14]，表明M1是子代vRNP出核的必需蛋白，同時(shí)也暗示新合成的M1需要入核才能幫助vRNP出核。研究顯示，在M1的多功能基序(殘基91～105)中，有富含堿性氨基酸的經(jīng)典核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)，位于殘基101RKLKR105。在空間構(gòu)象上，NLS位于M1的N-末端結(jié)構(gòu)的表面，在α-螺旋H6和H7之間形成一個(gè)暴露的環(huán)。NLS是M1入核的關(guān)鍵因素，缺失NLS的M1不能入核[15]。新合成的M1在入核后，位于M1轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)中的殘基R/K95、K98和K102可以與vRNP互作[16]，調(diào)節(jié)vRNP中RNA聚合酶的活性，從而適時(shí)阻止vRNA的轉(zhuǎn)錄，以利于vRNP的順利出核。但是，新合成的M1并非全部入核，留在細(xì)胞質(zhì)中的部分M1能夠阻止已經(jīng)出核的vRNP再次入核[14]。

2.3 介導(dǎo)病毒的裝配和出芽M1被稱為IAV組裝的“適配器”。作為樞紐，M1通過與病毒的其他蛋白協(xié)同作用以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜彎曲，再通過與NP的互作將vRNP整合到出芽部位。M1與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合和M1的寡聚化是病毒粒子組裝過程中兩個(gè)密切相關(guān)的過程。當(dāng)M1單體(或二聚體)與質(zhì)膜結(jié)合后，會(huì)觸發(fā)M1在質(zhì)膜下重排形成螺旋狀的寡聚體，并暴露出另一側(cè)以便與未結(jié)合的M1分子互作[9]。結(jié)合到質(zhì)膜上的M1通過與HA、NA和/或M2的胞質(zhì)尾區(qū)互作，從而誘導(dǎo)質(zhì)膜彎曲，此即病毒的出芽位置。作為招募vRNP的?？奎c(diǎn)，與質(zhì)膜結(jié)合的M1通過其C-末端與vRNP中的NP蛋白結(jié)合，由此將vRNP運(yùn)送至質(zhì)膜處。在此，vRNP被選擇性地裝配到出芽的病毒粒子中[17]。

3 M1對(duì)IAV生物學(xué)表型的影響

3.1 維持病毒形態(tài)M1在出芽病毒粒子的囊膜下形成一層基質(zhì)，為病毒囊膜提供剛性支撐。多項(xiàng)研究表明，M1是維持和調(diào)節(jié)IAV形態(tài)表型的決定性遺傳因素[18]。例如，將以絲狀表型為主的2009年新甲型H1N1流感病毒的M1基因替換到A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)中，可以使PR8由球形變?yōu)榻z狀[19]。此外，M1的氨基酸殘基突變也可以影響病毒粒子的形態(tài)表型。例如，N30D和T215A突變會(huì)使A/Duck/Guangxi/53/2002(H5N1)由球狀變?yōu)榻z狀。K102A突變的A/WSN/1933(H1N1)(WSN)可以形成絲狀粒子，而K95A、K98A、R101A、K102A的協(xié)同突變則可使WSN的形狀和大小各異，并且其形態(tài)表型會(huì)隨溫度改變[20]。R95K和E204D突變會(huì)降低A/Udorn/307/1972(H3N2)的絲狀表型[21]。將PR8經(jīng)豚鼠反復(fù)傳代后，它的M1逐漸出現(xiàn)87，92，101，157等位點(diǎn)的累積突變，最終使PR8由球形變?yōu)榻z狀[22]。但是，某些M1位點(diǎn)變異會(huì)導(dǎo)致病毒粒子出芽異常，由此釋放出更長的病毒粒子[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在IAV組裝時(shí)，不同的M1螺旋轉(zhuǎn)角也會(huì)影響病毒的形態(tài)[9]。

3.2 影響病毒的復(fù)制研究顯示，M1能夠通過自身的代償性突變修復(fù)基因缺失病毒的復(fù)制力。例如，缺失NS1的WSN經(jīng)過連續(xù)傳代后發(fā)生M1/A14U變異，盡管M1的mRNA水平受到影響，但是病毒的其他蛋白表達(dá)水平均不受影響。NINPAN等[24]研究發(fā)現(xiàn)，A/ostrich/Zimbabwe/222-E3/1996(H7N1)的NP蛋白在A549細(xì)胞中存在出核缺陷，但是NP的297位和M1的227位在傳至第10代的協(xié)同突變可以挽救病毒的復(fù)制缺陷。此外，M1的翻譯后修飾也影響病毒的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，M1/242K的SUMO化在M1-vRNP復(fù)合體形成，vRNP出核、轉(zhuǎn)運(yùn)、裝配，以及病毒的出芽過程中均發(fā)揮重要作用。當(dāng)M1發(fā)生K242E突變時(shí)，M1與vRNP的結(jié)合能力降低，影響M1-vRNP復(fù)合體的形成和vRNP的出核，從而阻礙病毒的復(fù)制[25]。M1還可以發(fā)生磷酸化修飾。M1的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基可以被蛋白激酶C和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化[26]。磷酸化位點(diǎn)在M1入核和病毒復(fù)制中的作用至關(guān)重要。去除M1第132位的磷酸化，會(huì)損害M1與importin-α1的結(jié)合，從而因M1的入核受阻導(dǎo)致病毒的復(fù)制力下降[27]。

3.3 影響病毒的毒力M1是IAV毒力的基礎(chǔ)。例如，A/Port Chalmers/1/73、A/FPV/34、PR8和WSN在適應(yīng)小鼠的過程中，M1的A41V突變能夠增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠的致病力。FAN等[28]發(fā)現(xiàn)，2株鴨源H5N1病毒均能致死雞，但只有1株對(duì)小鼠具有致病力。究其原因，發(fā)現(xiàn)M1的30和215位是影響H5N1病毒毒力的重要氨基酸位點(diǎn)。

3.4 影響病毒的傳播能力M1影響病毒傳播能力的證據(jù)基于2009年新甲型H1N1流感病毒。當(dāng)將A/California/4/2009的M1基因替換到PR8時(shí)，能夠恢復(fù)PR8在豚鼠的傳播能力。二者的差別在于PR8的M1第41位編碼V，而A/California/4/2009的M1編碼A[19]。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，M1/41位是IAV有效傳播的重要位點(diǎn)[29]。由于M1/41位不僅影響病毒的形態(tài)，還與傳播能力有關(guān)，據(jù)此推測(cè)病毒的形態(tài)與其傳播能力有關(guān)。一般認(rèn)為，天然的絲狀表型更有利于病毒的傳播[30]。

4 小結(jié)與展望

作為一種多功能蛋白質(zhì)，M1在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。與暴露在IAV表面的兩種糖蛋白HA和NA相比，IAV的內(nèi)部蛋白進(jìn)化速度較慢，其中M1是進(jìn)化最慢的蛋白之一。對(duì)全球不同物種來源的、不同亞型IAV的序列分析顯示，M1氨基酸的序列一致性超過95%[31]。較低的變異頻率可能是由于M1受到的選擇壓力強(qiáng)度較低，因此沒有必要經(jīng)常“變臉”。而更可能的原因是，M1的多功能角色使其對(duì)變異做出了自我約束，當(dāng)然也可能是因?yàn)槠渥陨沓惺懿涣诉^多的突變。此外，M1殘基的低突變耐受性也反映了其位點(diǎn)在病毒感染周期中的重要作用。作為豐度最高的IAV蛋白，M1的低突變耐受性暗示它在維持病毒結(jié)構(gòu)與功能方面所發(fā)揮的作用不容小覷。從M1蛋白的適應(yīng)性著手，開展以M1各個(gè)變異表型功能為導(dǎo)向的分子基礎(chǔ)研究，有望成為解析IAV物種適應(yīng)性差異和流行優(yōu)勢(shì)更迭的切入點(diǎn)。

此外，序列的高度保守性使M1成為一個(gè)理想的廣譜抗病毒靶點(diǎn)。據(jù)推測(cè)，通過一個(gè)小分子“楔形物”與M1-M1界面緊密結(jié)合，以此破壞M1的寡聚化，將產(chǎn)生一類全新的抗流感藥物。為了證明其可行性，KORDYUKOVA等[13]對(duì)一個(gè)超過70 000種的商用小分子庫進(jìn)行了虛擬篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了有進(jìn)一步研究價(jià)值的M1的“楔形物”抑制劑。生物物理學(xué)研究表明，一些抑制劑確實(shí)能夠通過與M1結(jié)合，由此削弱M1-M1的自締合作用，進(jìn)而降低了成熟病毒粒子中基質(zhì)層的厚度，導(dǎo)致季節(jié)性H1N1、大流行性H1N1、H3N2和H5N1等多株流感病毒在雞胚中的復(fù)制受到抑制。因此，M1有望成為一個(gè)全新的抗流感廣譜藥物的理想靶點(diǎn)。