牛支原體病實驗室診斷技術(shù)研究進展

劉紅燕，郭亞男，閆背背,，王建東，岳 康,，何生虎*

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）是無細胞壁的原核生物，侵入機體后可導(dǎo)致多種臨床癥狀，如肺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、乳房炎甚至孕畜流產(chǎn)等[1-2]。牛支原體呈世界性分布，造成的經(jīng)濟損失難以估量[3]。1961年，牛支原體首次從有乳房炎的牛乳中分離出來，10多年后，研究確定了牛支原體可引發(fā)各類呼吸系統(tǒng)疾病[4]。2008年，我國首次從患病犢牛肺臟中分離到該病原體，隨后我國10多個省市陸續(xù)發(fā)生了牛支原體病，嚴重影響了我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[5]。在集約化牛場中，伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，牛支原體的感染率和發(fā)病率也隨之增加，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了難以挽回的損失。因此，應(yīng)用高靈敏度、高精確度的牛支原體快速檢測技術(shù)尤為重要。目前，對牛支原體檢測技術(shù)的研究主要有4個方面：病原學(xué)診斷方法、免疫學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法。

1 病原學(xué)診斷方法

牛支原體感染后無示病癥狀，通常與巴氏桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯等其他病原菌混合感染，采用實驗室診斷技術(shù)有助于確診。檢測和鑒定牛支原體可采用微生物培養(yǎng)方法，因為支原體結(jié)構(gòu)簡單，膽固醇、長鏈脂肪酸和生長因子等不能由自身提供，所以培養(yǎng)基中要加入血清、酵母浸出液、蛋白胨和葡萄糖等其他試劑；同時，培養(yǎng)基pH值須調(diào)至7.3～7.8，pH值低于7.0會抑制其生長。由于牛支原體基因組較小，生物合成途徑有限，對營養(yǎng)和環(huán)境的需求比一般細菌高，因此要在培養(yǎng)基中加入20%馬血清，置于含有5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d左右，在光學(xué)顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基，菌落會呈現(xiàn)出特有的“油煎蛋”形態(tài)。雖然分離鑒定法是診斷牛支原體病的“金標準”，但由于牛支原體人工培養(yǎng)難度大、生長周期長，費時費力，因此該方法存在一定的局限性[6]。

2 免疫學(xué)診斷方法

2.1 免疫組化

研究者通過免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)機體感染牛支原體后會引起嚴重的肺部病變，肺間質(zhì)擴大，外觀呈現(xiàn)大理石樣病變，并且在支氣管上皮細胞表面和細胞質(zhì)內(nèi)均檢測到牛支原體抗原。Rodríguez等[7]通過免疫組織化學(xué)方法評估了自然發(fā)生和實驗誘導(dǎo)感染牛支原體肺炎后犢牛機體內(nèi)炎性病變中環(huán)氧化酶的表達，結(jié)果顯示牛支原體抗原位于呼吸道管腔和周圍壞死組織的上皮細胞和炎癥細胞中，并且在支氣管、細支氣管、肺泡上皮細胞和巨噬細胞中均檢測到環(huán)氧化酶，結(jié)果顯示環(huán)氧化酶蛋白在牛支原體感染期間過度表達，它始終與肺炎區(qū)域牛支原體抗原的存在有關(guān)。Nunoya等[8]利用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)患牛支原體肺炎的犢牛肺組織有深紅色實變區(qū)域，同時伴隨有亞急性化膿性細支氣管炎以及周圍淋巴組織增生。該方法在肺炎病灶的細支氣管上皮細胞表面、細胞質(zhì)和細支氣管吞噬細胞的細胞質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)牛支原體抗原存在。

2.2 免疫印跡

牛支原體膜蛋白種類豐富，包括VSP家族成員、pMB67、P26、P30和P48等抗原蛋白。目前學(xué)者普遍認為，牛支原體導(dǎo)致的呼吸道感染具有大量免疫病理學(xué)成分，其特征是感染組織中淋巴細胞大量積聚、炎細胞因子和肺部炎癥出現(xiàn)。Chen等[9]利用免疫印跡法對牛支原體進行定量和定性檢測，結(jié)果顯示P27是牛支原體的膜蛋白，這有助于了解牛支原體的分子致病機制。Kumar[10]通過免疫印跡法區(qū)分牛支原體（M.bovis）和無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）的免疫原性蛋白，發(fā)現(xiàn)這2種支原體的蛋白質(zhì)譜幾乎相似，存在許多發(fā)生交叉反應(yīng)的多肽，但可以用特異性免疫原性蛋白進行區(qū)分。

3 血清學(xué)診斷方法

3.1 ELISA

血清學(xué)診斷是檢測牛支原體的有效方法，其特異性和靈敏性都較高。Fu等[11]基于重組P48蛋白和單克隆抗體（10E）建立了直接競爭ELISA方法，并且與其他病原體無交叉反應(yīng)。通過對比試驗，發(fā)現(xiàn)這種直接競爭ELISA方法的陽性檢出率高于商品化間接ELISA試劑盒的檢出率。胡國明[12]將P48蛋白純化后包被在96孔板上檢測單克隆抗體效價，其效價可達640 000左右，并且與其他病原體無交叉反應(yīng)，具備特異性高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點。Han等[13]將蛋白作為包被抗原，檢測牛支原體的特異性抗體，從而建立了檢測該病原體的ELISA方法。在此方法基礎(chǔ)上，研發(fā)出了硫氰酸鈉（NaSCN）競爭ELISA法，用于檢測IgG親和力，成功建立起了能區(qū)分免疫牛和感染牛的檢測方法，并且能可靠評估牛支原體感染程度和疫苗效價。ELISA檢測方法操作簡單、快速，在調(diào)查大規(guī)模流行病學(xué)時具有顯著優(yōu)勢。

3.2 膠體金

膠體金免疫層析法是20世紀80年代誕生的一項快速檢測技術(shù)，它是以膠體金作為示蹤物，用于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫標記技術(shù)。簡瑩娜[14]基于牛支原體分離菌株的P48重組蛋白，構(gòu)建了膠體金免疫層析試紙條檢測方法，該試紙條檢測牛支原體高免血清效價可至1∶106。與間接血凝試驗法相比較（IHA），膠體金免疫層析法陽性檢出率和陰性檢出率都在93%以上，具有檢測速度快、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，適用于牛支原體的快速檢測。周華倩等[15]利用牛支原體重組膜蛋白P48和P80雙抗原建立了免疫膠體金抗體檢測試紙條方法，該方法可以檢出人工感染和接種疫苗2周后牛血清中的支原體抗體。通過最低檢測下線、交叉反應(yīng)性和人工感染血清檢測等試驗發(fā)現(xiàn)，該試紙條的特異性和敏感性較好，適用于臨床血清中牛支原體的快速檢測。膠體金免疫層析法不需要實驗室儀器和專業(yè)人員，操作簡單，數(shù)分鐘內(nèi)便可得到可視化結(jié)果，更適合于生產(chǎn)一線的現(xiàn)場應(yīng)用。

4 分子生物學(xué)診斷方法

4.1 普通PCR及熒光定量PCR方法

分子生物學(xué)診斷方法是牛支原體實驗室診斷中的最常用方法。PCR技術(shù)比其他檢測方法具有更高檢測效率，它是鑒別牛支原體與其他支原體的一項重要檢測技術(shù)[16]。當前基于牛支原體P48、P80和Polc等為靶基因建立的PCR檢測方法取得了優(yōu)異的檢測效果[17]，因此市售檢測試劑盒不斷研發(fā)出來。包世俊等[18]依據(jù)牛支原體脂蛋白P48基因序列，設(shè)計了一對具有特異性的引物，建立了牛支原體的PCR檢測方法。結(jié)果顯示，常見病原菌的DNA樣品無相應(yīng)的擴增條帶，其可檢測出的牛支原體DNA最低下限濃度約為0.002 875 ng/mL，該方法的檢出率與病原分離率一致。翟肖輝等[19]將牛支原體P80基因作為靶基因，設(shè)計出了qPCR特異性引物及探針，建立了牛支原體的TaqMan探針檢測方法，最低檢測下限為3.89 copies/μL，其靈敏度是普通PCR的4～10倍，為牛支原體的快速診斷和核酸定量檢測提供了方法。該方法具有檢測速度快、定量準確、靈敏度高等優(yōu)點，為各類疫病防控奠定了基礎(chǔ)。

4.2 多重PCR方法

Parker等[20]根據(jù)牛支原體基因，設(shè)計了特異性引物，建立了一種多重PCR方法，同時檢測鼻拭子、奶樣和精液中的牛支原體。結(jié)果顯示，PCR檢測線最低的是奶樣，其次是鼻拭子和精液。楊莉等[21]利用牛支原體oppD基因序列、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因序列和牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列，設(shè)計出了3對特異性引物，建立起多重PCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法能同時對這3種病原體的靶基因進行擴增，特異性強、靈敏度高，并且可以對單一感染和混合感染進行鑒別診斷。邢小勇等[22]基于牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）gB基因、牛支原體P48基因和肺炎克雷伯（KP）khe基因，設(shè)計了3對特異性引物，從而建立起檢測這3種病原體的多重PCR技術(shù)。結(jié)果顯示，IBRV最低檢出量為103TCID50，牛支原體最低檢出量為6.5×101cfu，KP的最低檢出量為8.1×101cfu，并且該方法與牛群中常見的其他病原體無交叉反應(yīng)。與傳統(tǒng)PCR方法相比較，多重PCR方法操作簡便，只需要加樣1次，運行1次反應(yīng)程序，便可檢測出多種病原體，具有成本低、檢出結(jié)果快等優(yōu)點。

4.3 等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP）是21世紀初誕生的一種新型核酸擴增技術(shù)。該方法操作簡單，不需要實驗室專業(yè)儀器，在60 ℃左右的等溫條件下，便可實現(xiàn)核酸擴增，其擴增效率是傳統(tǒng)PCR方法的10倍以上。Itoh等[23]將超快速提取技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)相結(jié)合，建立起更簡單、更快速、更靈敏的方法檢測牛奶中的牛支原體。結(jié)果表明，該方法可以在120 min內(nèi)得到檢測結(jié)果，對罐裝奶、初乳以及乳腺炎奶均適用。范晴等[24]基于牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的保守基因序列，設(shè)計了2對特異性的LAMP引物，建立了能夠檢測牛支原體和IBRV的雙重?zé)晒釲AMP檢測方法。結(jié)果顯示，該方法與其他病原體無交叉反應(yīng)，最低檢測線可達到100 copies/μL。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可用于臨床大量樣本的檢測，但存在假陽性高的缺點，雖然目前已經(jīng)找到措施對其進行優(yōu)化，但仍需進一步驗證[25]。

RPA技術(shù)利用重組酶與引物結(jié)合形成DNA復(fù)合物，對模板中的靶基因進行對數(shù)式擴增，在數(shù)分鐘內(nèi)便可得到擴增產(chǎn)物。翟肖輝等[26]利用牛支原體P80基因序列，設(shè)計了特異性引物和探針，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了牛支原體的RPA檢測方法。最后將RPA與側(cè)向流（LF）試紙條結(jié)合，形成LF-RPA檢測方法，其最低可檢測基因組DNA 5 pg/μL，與熒光定量PCR檢測結(jié)果符合率為94%。該方法可現(xiàn)場操作，檢測結(jié)果可視化，為牛支原體快速檢測提供了技術(shù)支持。Li等[27]基于牛支原體的uvrC基因，建立了熒光檢測的RPA技術(shù)（實時RPA）與測流試紙條（LF）相結(jié)合的檢測技術(shù)，最低檢測線為1.0×101copies/μL，與熒光定量PCR檢出率一致。該方法未與其他病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，可有效檢測牛支原體。

5 小結(jié)與展望

現(xiàn)階段牛支原體的實驗室診斷技術(shù)已經(jīng)取得了較大進展，但每種診斷方法都存在著一定程度的局限性，在進行診斷時，可以綜合考慮多種因素進行選擇，多種診斷方法聯(lián)合檢測以提高牛支原體診斷的精確度。隨著研究者對牛支原體的研究不斷深入，快速、準確、新型的診斷技術(shù)逐漸被報道，為牛支原體的診斷提供了科學(xué)依據(jù)。相信未來會有更多可靠、靈敏、成本低的診斷技術(shù)出現(xiàn)，為牛支原體病的防控奠定堅實基礎(chǔ)。