基于流感疫苗生產(chǎn)用MDCK細(xì)胞的安全性評價(jià)

康碧靜，馬芳芳，馬春英，王美皓，喬自林，王家敏*

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010；4.蘭州民海生物工程有限公司甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730010；5.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細(xì)胞是Madin和Darby于1958年從一只雌性成年可卡犬腎臟組織中分離得到的一株細(xì)胞系[1]。體外培養(yǎng)過程中，MDCK細(xì)胞形成自發(fā)永生化，研究發(fā)現(xiàn)，其對A型和B型流感病毒，柯薩奇病毒B3、B4和B5，呼腸孤病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒等都具有易感性[2]。因此，MDCK細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織推薦的最適宜生產(chǎn)流感疫苗的細(xì)胞系之一[3]。目前，生產(chǎn)MDCK細(xì)胞基質(zhì)的流感疫苗主要有：2001年，Solvay公司生產(chǎn)的三價(jià)流感疫苗Influvac? TC在荷蘭獲得審批，但由于生產(chǎn)延誤而未上市；Novartis公司使用無血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系MDCK 33016-PF生產(chǎn)的三價(jià)亞單位疫苗Optaflu?在歐盟獲得審批[4]；Seqirus公司四價(jià)流感疫苗Flucelvax? Tetra于歐盟上市；在美國，F(xiàn)lucelvax Quadrivalent?獲得審批上市[5]。相比傳統(tǒng)雞胚基質(zhì)流感疫苗，細(xì)胞基質(zhì)疫苗具有以下優(yōu)勢：一是生產(chǎn)過程都在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，全程質(zhì)量監(jiān)控，保證了無菌性及產(chǎn)品質(zhì)量[6]；二是如遇禽流感暴發(fā)，可有效避免雞胚供應(yīng)受限的影響[7]；三是雞胚基質(zhì)在病毒繁殖過程中會產(chǎn)生適應(yīng)性變異，而細(xì)胞基質(zhì)無此問題[8]；四是靈活性強(qiáng)、成本低，保障了對雞胚過敏人員的疫苗供應(yīng)。但在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，MDCK細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)注射后會使裸鼠產(chǎn)生腫瘤。如李六金等[9]用包括MDCK細(xì)胞等5種傳代細(xì)胞系對裸鼠進(jìn)行注射，發(fā)現(xiàn)在30代以后，MDCK細(xì)胞會使裸鼠形成腫瘤。因此，MDCK細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的安全性存在爭議。基于此，對MDCK細(xì)胞在流感疫苗生產(chǎn)安全性方面進(jìn)行評價(jià)非常有必要，也是疫苗獲得審批的關(guān)鍵。

1 MDCK細(xì)胞成瘤性研究

細(xì)胞成瘤性是指細(xì)胞在接種動物后，接種細(xì)胞在動物體內(nèi)形成（腫）瘤的過程，成瘤性檢查是確定細(xì)胞形成（腫）瘤的能力。通常對裸鼠或抗胸腺血清（ATS）處理過的新生小鼠進(jìn)行皮下接種，每只接種107個(gè)活細(xì)胞，在觀察至少4個(gè)月后處死，取出腫瘤以及其他器官（心、肝、脾、肺、腎、腦、部分淋巴結(jié)）進(jìn)行組織學(xué)檢測，判斷是否有成瘤性[10]。美國FDA和歐洲藥典的檢測方式基本相似。1976年，Stiles等[11]在BALB/c裸鼠的肩胛骨進(jìn)行細(xì)胞注射來檢驗(yàn)其細(xì)胞成瘤性，每周測量裸鼠肩胛骨結(jié)節(jié)尺寸，當(dāng)長度超過5 mm時(shí)，細(xì)胞系歸為致瘤細(xì)胞系，接種細(xì)胞數(shù)量為106/只。結(jié)果在新生裸鼠上注射時(shí)，MDCK細(xì)胞使裸鼠生長出0.5～0.6 mm的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)生長在30 d以內(nèi)，當(dāng)裸鼠體重到達(dá)成年體重時(shí)，結(jié)節(jié)不再生長。而在抑制其免疫能力的成年裸鼠中注射時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不變，未能形成結(jié)節(jié)。從結(jié)節(jié)中提取出活的MDCK，通過組織學(xué)切片檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)不是連續(xù)的腫瘤塊，而是含有單層柱狀上皮細(xì)胞的空心球。李六金等[9]對5種動物傳代細(xì)胞系：MDCK、Vero、F81、BHK21、MA-104進(jìn)行裸鼠注射來檢測其成瘤性。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)81、Vero和MA-104有腫塊形成，但經(jīng)過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫塊并非腫瘤，因此不是成瘤性細(xì)胞系。MDCK細(xì)胞在30代以下不具有成瘤性，在30代以上形成的腫塊進(jìn)行組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn)大部分為皮膚組織和肉芽組織，且有壞死，而一部分結(jié)節(jié)為纖維性肉瘤細(xì)胞，異型性明顯，將MDCK細(xì)胞裂解后接種于裸鼠皮下，無腫塊形成，因此，MDCK細(xì)胞裂解物沒有致瘤性。MDCK細(xì)胞的成瘤性主要通過2個(gè)參數(shù)評估：腫瘤形成能力和腫瘤潛伏期。腫瘤形成能力可以用腫瘤形成劑量的log1050%來表示，簡稱TPD50；腫瘤潛伏期是指腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間，可以用2種方法表示，一種是生存曲線，另一種是接種到出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，MDCK細(xì)胞成瘤性有異質(zhì)性，即不同MDCK細(xì)胞系成瘤率和腫瘤形成時(shí)間不同，從ATCC不同時(shí)間引進(jìn)3株不同的MDCK細(xì)胞系，進(jìn)行裸鼠注射，細(xì)胞株1的TPD50為4.4，細(xì)胞株2的TPD50為5.2，細(xì)胞株3的TPD50為5.8。腫瘤潛伏期也可反映其異質(zhì)性，每只裸鼠106的注射條件下，3株細(xì)胞系的潛伏時(shí)間也不相同。關(guān)于這種異質(zhì)性，有2種解釋，一種是在細(xì)胞傳代過程中，產(chǎn)生了成瘤表型突變；另一種是在不同的細(xì)胞批次中含有致瘤表型不同的細(xì)胞亞群，每個(gè)亞群在體內(nèi)形成腫瘤的能力不同[12]。Ganguly等[13]使用無胸腺雌性小鼠進(jìn)行成瘤性試驗(yàn)，每10只為一組，每只107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行皮下注射，陽性對照為HT-29細(xì)胞；后又進(jìn)行TPD50研究，使用雌性免疫缺陷小鼠進(jìn)行皮下注射和鼻內(nèi)注射，皮下注射MDCK細(xì)胞濃度分別為101、103、105、107個(gè)活細(xì)胞/只，陽性對照Hela為107個(gè)活細(xì)胞/只，而鼻內(nèi)注射細(xì)胞濃度為106個(gè)/只，陽性對照Hela和陰性對照Mrc-5也是同樣濃度。后又用新生免疫缺陷小鼠、新生倉鼠、新生大鼠檢測MDCK細(xì)胞致瘤性。結(jié)果表明：皮下注射小鼠從第9～40 d腫瘤體積增長，陽性對照腫瘤體積比MDCK細(xì)胞組大，組織學(xué)觀察未見腫瘤轉(zhuǎn)移，TPD50為1.9×104個(gè)細(xì)胞。通過注射MDCK細(xì)胞裂解物及DNA發(fā)現(xiàn)除有1只大鼠出現(xiàn)腫瘤外，其余均無腫瘤產(chǎn)生，鼻內(nèi)注射3株細(xì)胞皆無腫瘤產(chǎn)生，因此鼻內(nèi)給藥的途徑不具有成瘤性。

2 MDCK細(xì)胞致瘤性研究

中國藥典中規(guī)定，致瘤性是指細(xì)胞成分接種動物后，誘導(dǎo)動物細(xì)胞本身產(chǎn)生腫瘤[10]，具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。為了檢測細(xì)胞致瘤性，將待測細(xì)胞DNA注射進(jìn)新生裸鼠、倉鼠、免疫缺陷小鼠，經(jīng)過至少4個(gè)月觀察，處死后檢查是否有腫瘤產(chǎn)生、是否有病灶轉(zhuǎn)移。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MDCK細(xì)胞不具有致瘤性，也就是說MDCK不會有致癌性。張德禮等[14]將4株MDCK細(xì)胞進(jìn)行完整細(xì)胞注射和裂解物注射，4株MDCK細(xì)胞系注射完整細(xì)胞裸鼠有腫瘤生成，而裂解物均未產(chǎn)生腫瘤，此結(jié)果與Ganguly等[13]研究結(jié)果一致，其中一只成瘤的大鼠經(jīng)過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤為良性。因此，MDCK完整細(xì)胞雖然具有成瘤性，但其裂解物及DNA沒有致瘤性或致癌性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對細(xì)胞基質(zhì)的要求，每劑量疫苗DNA殘留量不得高于10 ng，另有研究證明如果在體內(nèi)有1 ng細(xì)胞的DNA，而基因組中有100個(gè)激活的致癌基因拷貝，則發(fā)生轉(zhuǎn)化的概率為1/109[15]，哺乳平均基因?yàn)? 000～10 000個(gè)堿基對，假設(shè)該哺乳動物基因組中DNA殘留量為10 ng，則該動物基因組中致癌基因?yàn)?.000 01～0.000 1 ng，目前沒有證據(jù)表明致癌基因及其他DNA在此數(shù)量級水平有生物活性[16]。

3 應(yīng)對策略

MDCK 33016-PF細(xì)胞可生產(chǎn)三價(jià)流感疫苗Optaflu?，但由于MDCK細(xì)胞的成瘤性，為了保證生物制品的安全性，必須要求疫苗中不含活細(xì)胞，保證細(xì)胞裂解物不致癌，保證細(xì)胞底物不含致癌病毒或致癌DNA。因此，有一系列后續(xù)純化工藝來確保其安全性。為了過濾細(xì)胞，首先進(jìn)行一個(gè)初始的離心步驟可過濾99%的細(xì)胞，其次進(jìn)行一次0.45 μm的過濾，再進(jìn)行兩次0.2 μm的過濾，最后再經(jīng)過0.2 μm的無菌過濾，MDCK細(xì)胞直徑約15 μm，而過濾孔徑很容易去除大量MDCK細(xì)胞，過濾的細(xì)胞依次大于9.2 log10、8.8 log10、8.8 log10、8.8 log10數(shù)量級；又經(jīng)過化學(xué)過濾，β-丙內(nèi)酯、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）以及聚山梨酯80（Tween 80）都可使MDCK細(xì)胞失活，通?？墒? log10數(shù)量級細(xì)胞失活。過濾純化后，每劑疫苗存在活細(xì)胞的概率為1/1034，而DNA的殘存量規(guī)定每劑量不超過10 ng。為了去除DNA，純化步驟包括硫酸纖維素離子交換層析和隨后的CTAB沉淀步驟，其中β-丙內(nèi)酯可與DNA發(fā)生反應(yīng)，使DNA斷裂，降低DNA聚合酶活性。這些生產(chǎn)步驟都能有效去除DNA殘留，使99.99%以上的殘余DNA長度低于200 bp，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于編碼致癌蛋白1 000 bp的長度，且凝膠電泳未檢驗(yàn)出大于200 bp的DNA片段[17]。因此，通過對MDCK致瘤性的研究和生產(chǎn)工藝的質(zhì)量控制，可保證疫苗生產(chǎn)的安全性。

理論上選用低成瘤甚至無成瘤的細(xì)胞系可大大降低疫苗成瘤性風(fēng)險(xiǎn)，Liu等[18]通過有限稀釋法克隆出MDCK 9B9-1E4，通過對其成瘤性、致瘤性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)成年裸鼠的結(jié)節(jié)在6個(gè)月后消失，有一只裸鼠雖產(chǎn)生腫瘤，但通過組織學(xué)和免疫組化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)腫瘤自發(fā)形成，并非注射形成。將MDCK細(xì)胞裂解物和細(xì)胞DNA進(jìn)行注射，雖然有動物產(chǎn)生腫瘤，但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)并非注射MDCK細(xì)胞裂解物及細(xì)胞DNA產(chǎn)生，系自發(fā)形成，從而證實(shí)MDCK 9B9-1E4是一株無成瘤細(xì)胞系，為了驗(yàn)證其成瘤特性，后又插入H-ras基因和MMP14基因，這2種基因都可激活小鼠c-myc基因?qū)е履[瘤形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的MDCK-Myc-Ras和MDCK-Src-MMP14在注射部位形成腫瘤，而MDCK 9B9-1E4未形成腫瘤[19]。因此，經(jīng)過疫苗生產(chǎn)過程中物理過濾及化學(xué)純化，在每劑流感疫苗中MDCK細(xì)胞存在的概率為1/1034，概率極低，所以MDCK細(xì)胞基質(zhì)的流感疫苗可認(rèn)為是安全的。

4 展望

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，流感病毒的醫(yī)療防控日漸升級，流感疫苗的需求日益增加，基于雞胚的流感疫苗產(chǎn)業(yè)早已無法滿足大眾需求，因此，細(xì)胞基質(zhì)的疫苗產(chǎn)業(yè)升級非常有必要。