酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)豬肉中喹諾酮類藥物步驟及注意事項(xiàng)

任艷娥

（朝陽縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 朝陽 122000）

喹諾酮類藥物常見的有洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑，是由人工合成的一類廣譜抗菌藥，對(duì)呼吸道疾病具有很好的治療效果，對(duì)厭氧菌、衣原體等也具有一定的作用，此類藥在2016年前被廣泛應(yīng)用在畜禽、水產(chǎn)等養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，后經(jīng)過相關(guān)專家的研究考評(píng)發(fā)現(xiàn)此類藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)，人類在食用了含有喹諾酮類藥物的動(dòng)物相關(guān)產(chǎn)品后會(huì)在其體內(nèi)蓄積，可引起耐藥性和潛在的致癌性，對(duì)人類身體健康產(chǎn)生一定危害，從而引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。因此2016年1月1日國(guó)家已經(jīng)明文規(guī)定在所有養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中全面停用喹諾酮類藥物（洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑）。

2012年以來，酶聯(lián)免疫吸附法成為遼寧省各縣區(qū)實(shí)驗(yàn)室快速篩查動(dòng)物產(chǎn)品及組織中喹諾酮類藥物殘留的主要檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)手段，此方法快速便捷、靈敏度高、易操作、受環(huán)境因素影響相對(duì)較小、成本相對(duì)較低等特點(diǎn)，適合廣大基層實(shí)驗(yàn)室大批量的篩查檢驗(yàn)，因此受到縣一級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的青睞。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)單其反應(yīng)原理淺顯易懂，樣品中的喹諾酮類藥物和試劑盒酶標(biāo)板上固定的抗原進(jìn)行特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)記物，再加入底物，底物受到催化顯色，然后根據(jù)顯色的深淺萊判斷樣品中奎諾酮類藥物的含量，顯色越深含量越少，反之顯色越淺含量則越多。筆者從事化驗(yàn)室殘留檢驗(yàn)檢測(cè)多年，在實(shí)際操作中積累了一定的慚怍經(jīng)驗(yàn)，下面將以檢測(cè)豬肉中喹諾酮類藥物為例簡(jiǎn)述檢驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)步驟及其注意事項(xiàng)。

1 樣品的前處理及注意事項(xiàng)

使用試劑盒前，仔細(xì)閱讀說明書(本文使用的是北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的喹諾酮類酶聯(lián)免疫試劑盒Ⅳ型96孔）。不要使用過了有效期的試劑盒，試劑盒應(yīng)在冰箱冷藏環(huán)境中存放，不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用，稀釋或摻雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化，最后導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組分及待檢測(cè)的豬肉（肌肉部分）樣品置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上恢復(fù)至室溫（25±2℃）（提示：約2小時(shí)），室溫如果低于25℃或試劑及樣本未回到室溫（20～25℃），會(huì)導(dǎo)致后面的OD值偏低，反之則偏高。應(yīng)避免使用金屬類物質(zhì)盛裝和攪拌試劑。各試劑在使用前請(qǐng)輕輕搖勻，混合時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。在酶標(biāo)板空中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)記工作液、抗體工作液、AB混合液、終止液的各操作步驟不得超過3分鐘。在操作過程中，應(yīng)盡量避免酶標(biāo)板上方的空氣流動(dòng)，尤其注意空調(diào)的風(fēng)不能直吹。

檢測(cè)過程中所用的槍頭為一次性使用，不得重復(fù)利用。需按比例配比的工作液要求配比。

樣品的前處理：（1）在電子天平上準(zhǔn)確稱取2±0.05克均質(zhì)后的樣品于50毫升離心管中。（2）依次加入0.1毫升磷酸溶液（分析純2毫升濃磷酸加入98毫升去離子水混勻）、6毫升乙腈，立即充分渦動(dòng)2分鐘。（3）離心機(jī)4000轉(zhuǎn)以上，至少離心5分鐘。（4）在離心后的離心管中取2毫升上清液于新的4毫升離心管中。（5）在通風(fēng)櫥內(nèi)，60～70℃水浴鍋中，針頭距離液面上方0.5～1厘米用氮?dú)獯蹈?。?）加入1毫升正己烷（在通風(fēng)櫥內(nèi)操作），充分渦動(dòng)30秒，再加入0.5毫升樣品復(fù)溶液（1份濃縮樣品+3份去離子水制成），低速渦動(dòng)30秒。（7）再到離心機(jī)上4000轉(zhuǎn)以上，離心5分鐘。（8）完全棄去上層正己烷及中間層雜質(zhì)。（9）取50微升上清液，加入到450微升樣品復(fù)溶液中，充分渦動(dòng)30秒。（10）取50微升進(jìn)行檢測(cè)（注意：切勿吸到上層雜質(zhì)）。

2 檢測(cè)步驟及注意事項(xiàng)

將板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，建議均做雙孔以上平行，未使用的板條用自封袋重新密封后，立即保存于冰箱冷藏2～8℃環(huán)境中記錄好日期；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光非常敏感，因此要避免直接暴露在光線下。用微量洗液槍吸取50微升各標(biāo)準(zhǔn)品工作液及樣品溶液分別加入到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中。注意事項(xiàng)為，移液器吸取液體時(shí)應(yīng)遵循快洗慢打的規(guī)則，建議采用吸二打一方式，可有效避免氣泡的產(chǎn)生，槍頭不要插到液面以下，也不要碰到孔壁，槍頭為一次性使用，不能重復(fù)利用。有條件的化驗(yàn)室可使用多道移液槍在每孔中加入50微升酶標(biāo)記物工作液，再在每孔中加入50微升抗體工作液。注意事項(xiàng)：標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、抗體一定要按順序添加，槍頭也為一次性使用。蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10秒，注意此過程不要將板內(nèi)液體震出板外，以免臨孔樣品被污染，充分混勻后，室溫下（25±2℃），避光反應(yīng)40分鐘。輕輕揭開蓋板膜，尋迅速倒掉板孔中液體，在每孔加入260微升洗滌工作液（1份濃縮洗滌液+19份去離子水混勻制成），充分洗滌4次，每次浸泡15～30秒；有條件的機(jī)構(gòu)建議購買自動(dòng)洗板機(jī)，洗3次即可，省時(shí)省力，需注意的是，每次倒掉板內(nèi)液體時(shí)動(dòng)作需快速，迅速翻轉(zhuǎn)，同時(shí)注意臨孔避免樣品交叉污染，影響到檢測(cè)數(shù)據(jù)。倒掉板孔中液體后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干，如孔內(nèi)有氣泡應(yīng)用干凈的槍頭搓破，不同的孔需更換槍頭，然后立即在每孔中加入 100微升的A、B混合液。注意事項(xiàng)：底物A液、底物B液應(yīng)按比例1∶1混合，必須充分混勻，混合液應(yīng)在5分鐘內(nèi)用完，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑，顯色液若有顏色變化表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)作廢。蓋好蓋板膜，用手輕輕振蕩酶標(biāo)板10秒，充分混勻，室溫下（25±2℃），避光反應(yīng)10～15分鐘；揭開蓋板膜后，在每孔中加入50微升終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10秒，充分混勻；注意反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚和衣服，如不小心噴濺到皮膚上應(yīng)立即用清水沖洗干凈，嚴(yán)重者立即就醫(yī)。加完終止液后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450納米、630納米下讀取酶標(biāo)板吸光度值，連接打印機(jī)打出檢測(cè)數(shù)據(jù)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)，此次操作失敗，同一樣品OD值相差不能超過0.2，反而該樣品得重新做。利用試劑盒專用分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果計(jì)算更加準(zhǔn)確，更適用于大批量樣本的快速檢測(cè)分析，計(jì)算過程中應(yīng)注意往軟件輸入數(shù)據(jù)時(shí)認(rèn)真填寫，保證數(shù)據(jù)的輸入的準(zhǔn)確性并需由另一名檢測(cè)人員進(jìn)行認(rèn)真校對(duì)后出具檢測(cè)報(bào)告，確認(rèn)無誤后簽字。整個(gè)操作過程需要檢測(cè)人員盡職盡責(zé)，每個(gè)環(huán)節(jié)緊密相連，嚴(yán)格按規(guī)程操作，是保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠的必要條件。