轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米遺傳育種中的應(yīng)用研究

張 茜，李 新，關(guān)雅靜

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750002）

玉米傳入中國400 多年來飛速發(fā)展，種質(zhì)資源舉足輕重。高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病蟲的優(yōu)質(zhì)基因是提高作物產(chǎn)量的重中之重[1]。在傳統(tǒng)的育種工作中，育種范圍相對狹窄，操作精準(zhǔn)度較低，良莠混雜，無法準(zhǔn)確選擇，實(shí)際的選育周期較長，并且選育效果也不理想。

1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米遺傳育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 基因工程的進(jìn)展及應(yīng)用概況

20 世紀(jì)80 年代，RELP 標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖被首次提出，各種遺傳標(biāo)記技術(shù)也取得了迅猛發(fā)展，并逐漸運(yùn)用至動植物遺傳領(lǐng)域中。1983 年，世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物在美國培育成功，轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究日新月異，研究水平不斷提高，品種培育呈代際特征，對農(nóng)業(yè)科技和生產(chǎn)力的發(fā)展具有強(qiáng)大的推動作用，轉(zhuǎn)基因商業(yè)化種植滲透程度加深，引領(lǐng)我國的育種行業(yè)進(jìn)入了全新的發(fā)展時(shí)代。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法眾多，主要包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等，其中，基因槍法是最常用、最有效的DNA 導(dǎo)入技術(shù)[2]。基因工程技術(shù)的廣泛運(yùn)用，對玉米品種改良、玉米病蟲害抗性等具有積極意義。

1.2 分子標(biāo)記技術(shù)在玉米遺傳育種中的運(yùn)用

玉米是運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)最早的作物之一，并且在長時(shí)間的發(fā)展與實(shí)踐中取得了不錯的運(yùn)用成果。在20 世紀(jì)80—90 年代，玉米分子標(biāo)記技術(shù)的研究主要停留在理論研究階段，研究成果為后續(xù)的實(shí)踐奠定了理論基礎(chǔ)。20 世紀(jì)90 年代以后，分子技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用開始增多，研究方向發(fā)生改變，以重要基因的定位研究為主。分子輔助標(biāo)記有著明顯的優(yōu)越性，可追蹤分子活動過程，直接以DNA 形式表現(xiàn)，加之受到外界因素影響較小，其發(fā)展較為迅速，種類不斷增加。目前，我國已開發(fā)運(yùn)用的分子標(biāo)記技術(shù)包括RELP、RAPD、AFLP 和SSR 等種類。

1991 年，世界上第一張玉米RFLP 連鎖圖譜被成功構(gòu)建，但其標(biāo)記相對較少，僅有50 個(gè)。在后續(xù)的研究中，相關(guān)科學(xué)家又增加標(biāo)記了217 個(gè)位點(diǎn)，借助B-A易位系，定位在染色體上。較其他標(biāo)記而言，SSR 標(biāo)記發(fā)展起步較晚，發(fā)展時(shí)間較短，但其以顯著的優(yōu)勢，發(fā)展迅速并且運(yùn)用廣泛。1994 年，某科學(xué)家利用（DE811×B73）組合，標(biāo)記了32 個(gè)SSR 位點(diǎn)。借助分子標(biāo)記圖譜，育種者能夠選擇目標(biāo)性狀的基因型，合理選擇育種方法，進(jìn)而提高育種計(jì)劃的科學(xué)性，提高玉米的產(chǎn)量與質(zhì)量。1994 年，某科學(xué)家鑒定3100 個(gè)頂交（B73×Mo17）的F4，發(fā)現(xiàn)其中有5 個(gè)QTL 對籽粒重量有多效性，主要在1、2、5、9 號染色體上，效應(yīng)最大的基因位于9 號染色體的短臂上。目前，科學(xué)家利用RFLP 等技術(shù)已經(jīng)標(biāo)記了玉米的許多重要性狀，如生育期、品質(zhì)、抗性等，覆蓋了整個(gè)基因組，為基因工程在玉米遺傳育種中的運(yùn)用提供了可靠保障[3]。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米遺傳育種中的主要方法

在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的過程中，轉(zhuǎn)基因方法也越來越多。相關(guān)人員需結(jié)合實(shí)際需要，合理選擇轉(zhuǎn)基因方法，以達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是研究最深入、使用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植物中60%以上都是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)的，可運(yùn)用到玉米轉(zhuǎn)基因操作中的主要有根癌農(nóng)桿菌、發(fā)根農(nóng)桿菌。其中，Ti 質(zhì)粒的研究最多，是現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的方法，可成功侵染到玉米中，在植物根部或莖基部傷口處形成冠癭瘤。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中，Ti 質(zhì)粒侵染玉米，T-DNA 從質(zhì)粒上脫離下來，被插入到該植株的基因中，并且后代不會發(fā)生性狀分離，能夠穩(wěn)定遺傳，但是并不會植入到植株細(xì)胞中，形成一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

現(xiàn)階段，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要用于雙子葉植物和裸子植物的遺傳轉(zhuǎn)化[4]。該方法通過使農(nóng)桿菌載體與植株體分生組織和生殖器官接觸來完成遺傳轉(zhuǎn)化。接觸可以通過真空滲透法、浸蘸法或注射法完成，然后利用組織培養(yǎng)、抗生素篩選和分子檢測培養(yǎng)和分離轉(zhuǎn)基因的子代植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的技術(shù)特點(diǎn)為技術(shù)成熟、操作簡單、快速，且成本低，容易掌握，外源基因低拷貝，轉(zhuǎn)化率高，可有效避免基因沉默現(xiàn)象，整合率高，篩選可靠，是目前制備轉(zhuǎn)基因植物成功率最高的方法，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中運(yùn)用廣泛。

2.2 基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法外使用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。基因槍也被稱為生物彈道技術(shù)，借助壓縮氣體產(chǎn)生的沖擊波，將粘有DNA 的細(xì)微金粒高速射入受體細(xì)胞或組織中，穿過層層結(jié)構(gòu)，直至到達(dá)細(xì)胞核。粘有DNA 的微粒在進(jìn)入細(xì)胞后，會被整合到宿主的細(xì)胞DNA 上，發(fā)生基因突變，完成基因轉(zhuǎn)移的目的[5]。基因槍法最早運(yùn)用于20 世紀(jì)90 年代，該種方法的優(yōu)勢顯著，不受物種和轟擊部位限制，不需要重復(fù)培養(yǎng)原生受體，操作簡單快捷，命中率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，無細(xì)胞特異性，不依賴基因型，受體材料、靶細(xì)胞來源廣泛。但是該種方法也存在一定的弊端，如對玉米細(xì)胞造成損害、嵌合體多、轉(zhuǎn)化成本高、遺傳性不穩(wěn)定、隨機(jī)性太強(qiáng)和整合效率低等。

2.3 花粉管通道法

花粉管通道法在我國應(yīng)用十分廣泛。其原理為利用植物天然授粉過程中花粉粒萌發(fā)形成的花粉管通道，通過花粉管通道，在自花授粉階段將外源基因?qū)肽遗撸怪仓曛苯赢a(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化后的種子。花粉管通道法的技術(shù)特點(diǎn)是不需要組織培養(yǎng)誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化后可直接得到種子，對設(shè)備要求低，轉(zhuǎn)化率高，可大批量轉(zhuǎn)化，利用植物天然授粉條件，適用作物類型廣泛。同時(shí)，該種方法操作簡單、很容易實(shí)施、育種周期短，可以轉(zhuǎn)化任何基因型材料，并直接運(yùn)用到常規(guī)育種中。此外，還有改進(jìn)的花粉管通道技術(shù)，選取自交授粉后的玉米果穗，時(shí)間以授粉后18～26 h 為宜，留下2 cm 的花絲，其余剪除，使用酒精消毒處理，沿穗軸將玉米花莖基部的葉子平均切成3 份，剝開，剪去部分花絲，滴加外源DNA溶液，使外源DNA 直接進(jìn)入幼胚，以降低遺傳變異的概率。但是，由于玉米花絲通常較長，且長短不一，操作難度較大，加之授粉時(shí)間的限制，導(dǎo)致外源DNA 片段上限受限，外源DNA 隨機(jī)整合的偶然性大，從而使其應(yīng)用受限。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米遺傳育種中的培育種類

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在我國各行各業(yè)中運(yùn)用均較為廣泛，尤其是在農(nóng)業(yè)中發(fā)展已經(jīng)相對較為成熟。玉米是我國第一大糧食作物，有著悠久的種植歷史，但其深受病蟲害的影響，是千百年來難以解決的“頑疾”。近年來，世界各國的農(nóng)業(yè)公司均紛紛推出了培育的轉(zhuǎn)基因玉米品種，玉米種植面積不斷擴(kuò)大，正逐漸形成商業(yè)化種植模式，獲得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。以下進(jìn)行詳細(xì)闡述。

3.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米

據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，嚴(yán)重蟲害可導(dǎo)致年份減產(chǎn)30%，嚴(yán)重病害導(dǎo)致平均減產(chǎn)10%。我國作為農(nóng)作物病蟲害多發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)，受玉米螟為害顯著，造成的玉米損失重大。在種子包衣中噴灑化學(xué)殺蟲劑，能夠預(yù)防部分侵蝕幼芽期的害蟲，一般不會對種芽造成傷害。但在植株生長過程中噴灑殺蟲劑，則會對生態(tài)平衡造成影響，破壞生態(tài)環(huán)境，造成農(nóng)藥污染等問題。在傳統(tǒng)的抗螟品種培養(yǎng)方法中，育種周期長，并且實(shí)際的育種效果也不佳。因此，科學(xué)家們開始探索更加安全、有效和經(jīng)濟(jì)的生物防治技術(shù)，經(jīng)過不斷嘗試，蘇云金芽孢桿菌（Bt）表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蟲效果。但是該種基因只對鱗翅目害蟲具有毒害作用，且在光照作用下容易分解，效果持續(xù)時(shí)間較短，在實(shí)際的田間操作中較為困難，難以作為商品制劑批量生產(chǎn)。

Bt 基因作為一種抗蟲基因，能夠在玉米包衣和植株的生長過程中代替化學(xué)殺蟲劑的功效[6]。Bt 芽孢在形成過程中會分泌毒蛋白，以原毒素的形式存在于體孢晶體中。該種原毒素在玉米植株體內(nèi)一旦被蟲體攝取，則會破壞昆蟲的腸道環(huán)境，在微堿性環(huán)境下，產(chǎn)生毒性肽鏈分子，在蟲體腸道表面產(chǎn)生受體，起到有效的抵抗作用，使幼蟲停止進(jìn)食，直到死亡，可使玉米產(chǎn)量平均增加9%。害蟲在取食玉米時(shí)，則會將該種蛋白攝取進(jìn)“肚中”，在堿性腸道環(huán)境下被活化，進(jìn)而殺死害蟲。而CpTL 基因?qū)τ衩酌⑶食崮坑衩赘~蟲、雜擬谷盜和直翅目蝗蟲等均具有抗性。

傳統(tǒng)的玉米除蟲措施一般使用化學(xué)殺蟲劑，但殺蟲劑對益蟲也有較強(qiáng)的殺傷力，且長期大量使用化學(xué)殺蟲劑不僅會造成環(huán)境污染，加劇生態(tài)環(huán)境破壞，還會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，容易引起人畜中毒。而依靠轉(zhuǎn)基因玉米，則能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑使用的弊端，并且防治效果較好。同時(shí)，為了避免或延緩害蟲產(chǎn)生抗藥性，還需采取相應(yīng)的防治措施，例如，混種部分普通玉米種子，或繼續(xù)篩選高抗蟲性雜交種。

3.2 抗除草劑玉米

玉米田間雜草對玉米的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)均具有不利影響，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，除草劑的使用越來越普遍，能夠節(jié)省勞動力、提高勞動效率、保護(hù)土壤結(jié)構(gòu)。但是，在使用除草劑的過程中，也會在一定程度上對玉米植株造成傷害，污染生態(tài)環(huán)境。在玉米植株的生長過程中，將抗除草劑轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用其中，可保證玉米健康生長，減少除草劑對玉米植株的傷害，降低種植成本，實(shí)現(xiàn)無公害除草，提高玉米產(chǎn)量，有助于節(jié)省人力、物力。

其中，IMI 作為一種優(yōu)質(zhì)的抗除草劑玉米，具有非常強(qiáng)的耐受性，除草劑能夠直接噴灑在玉米植株上，對1 年生雜草、寬葉雜草的生長均具有良好的防治效果。

3.3 改良玉米類蛋白轉(zhuǎn)基因玉米

玉米作為一種糧食作物與經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量雖然較為可觀，但整體品質(zhì)卻不容樂觀，玉米蛋白質(zhì)中賴氨酸含量較低。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的過程中，通過將外源基因?qū)肫胀ㄓ衩字?，可得到?yōu)良性狀的玉米。由于玉米中賴氨酸較少，科學(xué)家利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將富含賴氨酸的馬鈴薯蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩變?nèi)，使玉米產(chǎn)量顯著提升[7]?；诖耍芯咳藛T開始將更加優(yōu)良的基因?qū)胗衩字仓曛?，以提高玉米中氨基酸的含量?/p>

4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米遺傳育種中的應(yīng)用分析

4.1 基因工程在玉米遺傳育種中存在的問題

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在實(shí)際的玉米遺傳育種運(yùn)用中仍存在一定的問題。例如，害蟲對Bt作物產(chǎn)生抗性，為了解決該問題，在種植玉米時(shí)，選擇抗蟲性轉(zhuǎn)基因玉米與普通玉米混種，可以有效治理害蟲抗性。CpTL 基因在使用中需要具備高效的表達(dá)條件，這也給轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實(shí)施帶來了較大挑戰(zhàn)，研究人員還需進(jìn)一步加深對不同調(diào)控機(jī)理的研究。同時(shí)，利用植物凝聚素基因?qū)嵤┗蚬こ痰难芯堪l(fā)展時(shí)間較短，其獲得的基因植株安全性有待進(jìn)一步證實(shí)。在環(huán)境方面，基因工程對生態(tài)環(huán)境的影響性研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)化率方面，也存在基因轉(zhuǎn)化率較低、遺傳不穩(wěn)定的問題。

現(xiàn)階段，我國的基因組研究已經(jīng)取得巨大成果，已獲得的轉(zhuǎn)基因植株均是在長時(shí)間的大量研究基礎(chǔ)之上得到的轉(zhuǎn)化體克隆，具有很強(qiáng)的基因型依賴性，再生頻率較低。同時(shí)，受到歷史條件與現(xiàn)有研究水平的限制，我國轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化亟須突破，需引起高度重視，想在短時(shí)間內(nèi)趕超發(fā)達(dá)國家任重道遠(yuǎn)。

4.2 基因工程在玉米遺傳育種中的發(fā)展應(yīng)用

種植轉(zhuǎn)基因作物可提高社會效益與經(jīng)濟(jì)效益、有效控制靶標(biāo)害蟲和作物害蟲、保持產(chǎn)量穩(wěn)定、降低化學(xué)農(nóng)藥的噴灑、減少環(huán)境污染、降低種植成本、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、提升農(nóng)產(chǎn)品競爭力。隨著轉(zhuǎn)基因玉米工程的進(jìn)一步發(fā)展，我國的轉(zhuǎn)基因玉米種植面積逐年提高，在提高肥料利用效率、防治病蟲害、克服土壤逆境、免耕、高效除草和降低勞動力成本等方面均具有重大意義，是解決現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重大問題的戰(zhàn)略性技術(shù)。目前，轉(zhuǎn)基因玉米安全性的爭論焦點(diǎn)主要集中在3 個(gè)方面。一是國際貿(mào)易與對人類的潛在影響；二是環(huán)境倫理和社會倫理與宗教問題；三是“標(biāo)簽風(fēng)波”，近年來，轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽問題在國際上一度引發(fā)激烈爭論[8]。為此政府部門需加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因安全管理，完善相應(yīng)的技術(shù)支撐體系，遴選相關(guān)領(lǐng)域的專家，組建安全委員會，展開轉(zhuǎn)基因作物安全評價(jià)與安全咨詢工作。重視并嚴(yán)格規(guī)范生物安全評價(jià)工作，相關(guān)研究人員需積極承擔(dān)社會責(zé)任、倫理責(zé)任，嚴(yán)格遵照相關(guān)法規(guī)，保證轉(zhuǎn)基因生物試驗(yàn)研究的規(guī)范性，公眾、科學(xué)家與政府需攜手共進(jìn)，維護(hù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全應(yīng)用，推動其良性發(fā)展。

5 結(jié)束語

過去，玉米所到之處，都給當(dāng)?shù)貛砹朔睒s，現(xiàn)在、未來，亦是如此。玉米作為全球第一大糧食作物，有170 多個(gè)國家種植玉米。隨著全球化的推進(jìn)，科研、企業(yè)的同場競技愈發(fā)激烈，玉米產(chǎn)業(yè)迎來了新的機(jī)遇，更面臨著全新挑戰(zhàn)。生物育種勢頭正猛，如何創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源、研究飼用玉米已成為廣大育種工作者需要解決的關(guān)鍵問題。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，良種是關(guān)鍵，借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)可實(shí)現(xiàn)基因重組，提高優(yōu)良品種的選育效率。在具體實(shí)踐過程中，相關(guān)人員還需在已有研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際情況，加強(qiáng)新型品種的研究，加深對玉米自交系、雜交系和農(nóng)家品種的遺傳多樣性的研究，重點(diǎn)選擇關(guān)鍵性狀進(jìn)行基因定位作圖，加強(qiáng)種質(zhì)創(chuàng)新，提高育種效率。在加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的同時(shí)，需密切關(guān)注轉(zhuǎn)基因玉米的安全性，評估其對生態(tài)環(huán)境的影響，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)走向適用化。