免疫檢查點阻斷轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展

何軍芳

（上海旭東海普藥業(yè)有限公司 上海 201206）

阻斷T細(xì)胞免疫檢查點通路是腫瘤治療策略之一，但現(xiàn)僅小部分患者能自此類免疫治療中獲益，相關(guān)藥物主要包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、程序性細(xì)胞死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）和程序性細(xì)胞死亡受體配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制劑等。抑制性免疫檢查點CTLA-4和PD-1除了調(diào)控急慢性炎性反應(yīng)、抗腫瘤等免疫反應(yīng)之外，還與機體免疫耐受相關(guān)，在保護(hù)機體免受自身免疫反應(yīng)方面起著重要作用。因此，使用免疫檢查點抑制劑治療會導(dǎo)致發(fā)生不同程度的免疫相關(guān)不良事件。為使更多腫瘤患者從免疫治療中獲益，改善患者預(yù)后，國內(nèi)外開展了大量的免疫檢查點阻斷相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。本文以抗腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)的代表性免疫細(xì)胞為例，包括樹突狀細(xì)胞、耗竭CD8+T細(xì)胞（exhausted CD8+T cells，Tex細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg細(xì)胞），概要介紹免疫檢查點阻斷相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展。

1 腫瘤調(diào)控樹突狀細(xì)胞抗原提呈以逃避免疫識別

CD8+T細(xì)胞是特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要功能性細(xì)胞，而樹突狀細(xì)胞在抗腫瘤T細(xì)胞免疫的啟動和維持中起著核心作用，是體內(nèi)抗原提呈能力最強的一類細(xì)胞。在抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中，樹突狀細(xì)胞首先攝取腫瘤抗原并通過人白細(xì)胞抗原Ⅰ（classⅠhuman leukocyte antigens，HLA-Ⅰ）交叉提呈以啟動初始CD8+T細(xì)胞，啟動后的CD8+T細(xì)胞對由HLA-Ⅰ直接提呈的腫瘤抗原進(jìn)行免疫識別，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[1]。

腫瘤內(nèi)的自然殺傷細(xì)胞通過分泌趨化因子CCL5和XCL1招募樹突狀細(xì)胞中的傳統(tǒng)1型亞群（conventional type 1 dendritic cells，cDC1）進(jìn)入腫瘤微環(huán)境[2]。cDC1攝取已死亡腫瘤細(xì)胞釋放的特異性抗原后不斷成熟，遷移至腫瘤引流淋巴結(jié)（tumor-draining lymph node，TDLN）后對腫瘤抗原進(jìn)行加工處理，然后加載至HLA-Ⅰ，交叉提呈于CD8+T細(xì)胞，同時上調(diào)共刺激分子CD80等表達(dá)并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，充分啟動初始T細(xì)胞[3]。

自然殺傷細(xì)胞-cDC1軸與腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存相關(guān)，而腫瘤源性前列腺素E2能減弱自然殺傷細(xì)胞的功能，使其趨化因子產(chǎn)生減少，并下調(diào)cDC1趨化因子相關(guān)受體的表達(dá)，導(dǎo)致cDC1招募減少[2]。在對免疫檢查點抑制劑耐藥的腫瘤內(nèi)有一類富含免疫調(diào)節(jié)分子的成熟樹突狀細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)存在腫瘤抗原攝取相關(guān)的調(diào)節(jié)程序：由受體酪氨酸激酶AXL誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)上調(diào)，白介素-12表達(dá)上調(diào)則嚴(yán)格依賴于干擾素-γ水平并受白介素-4信號傳導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控，由此減弱cDC1的免疫功能，從而限制TDLN中的T細(xì)胞活化[4]。此外，腫瘤內(nèi)樹突狀細(xì)胞的氧化脂質(zhì)水平升高，并可通過與熱休克蛋白70共價結(jié)合，介導(dǎo)抑制樹突狀細(xì)胞對腫瘤抗原的交叉提呈[5]。

總之，腫瘤細(xì)胞能利用多種免疫逃逸機制在腫瘤抗原提呈過程中逃避免疫識別及殺傷，它們除可直接調(diào)控自身抗原加工和下調(diào)HLA-Ⅰ表達(dá)之外，還可通過影響cDC1招募、成熟和抗原交叉提呈等環(huán)節(jié)，抑制cDC1的抗腫瘤免疫功能。因此，腫瘤區(qū)域的樹突狀細(xì)胞經(jīng)常呈現(xiàn)功能失常、耐受性甚至免疫抑制性表型。對經(jīng)免疫檢查點抑制劑治療反應(yīng)不良的免疫抑制性腫瘤，聯(lián)用干擾素基因刺激因子激動劑可以克服免疫抑制信號并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，提高免疫治療效果[6]。

2 阻斷樹突狀細(xì)胞PD-L1可增強T細(xì)胞CD28信號傳導(dǎo)

研究發(fā)現(xiàn)，通過PD-L1激活PD-1信號通路，募集蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2，可使T細(xì)胞共刺激受體CD28去磷酸化，從而阻斷CD28信號傳導(dǎo)，抑制T細(xì)胞活化，表明PD-L1/PD-1信號通路主要通過減弱CD28的共刺激信號而調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的功能[7]。

樹突狀細(xì)胞表達(dá)的PD-L1既可與T細(xì)胞的PD-1結(jié)合，由此傳遞抑制性信號，也可與自身的B7-1（CD80）發(fā)生相互作用，進(jìn)而阻斷B7-1/CD28共刺激信號，抑制T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[8]。PD-L1/B7-1的親和力介于B7-1/CD28和B7-1/CTLA-4之間[8]。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平高于B7-1，且其PD-L1可與B7-1順式結(jié)合，而其他游離的PD-L1則與T細(xì)胞的PD-1反式結(jié)合[9]。給予抗PD-L1抗體除了可阻斷PD-L1/PD-1抑制性信號傳導(dǎo)之外，還可破壞PD-L1/B7-1的順式結(jié)合，釋放被PD-L1結(jié)合的B7-1，使得B7-1能與CD28結(jié)合而提供共刺激信號，增強T細(xì)胞啟動[9]。實驗表明，給予抗PD-1抗體后，CD28的信號傳導(dǎo)增強了32%；再加用抗PD-L1抗體，CD28的信號傳導(dǎo)增幅提高至52%[9]。臨床上觀察到，在接受阿替利珠單抗治療的腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤相關(guān)PD-L1+樹突狀細(xì)胞的存在與患者臨床獲益增加相關(guān)，這與上述基礎(chǔ)研究結(jié)果一致[9]。

此外，有研究證實，敲除樹突狀細(xì)胞的PD-L1可顯著限制腫瘤生長，增強抗腫瘤CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。盡管腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞均可表達(dá)PD-L1，但樹突狀細(xì)胞表達(dá)的PD-L1在抗腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用[10]。該研究結(jié)果同樣確認(rèn)了樹突狀細(xì)胞在PD-L1/PD-1信號通路中的重要作用，有助于更深入地理解通過免疫檢查點阻斷治療腫瘤的機制。

3 阻斷PD-1信號通路可擴(kuò)增具有循環(huán)潛能的Tex細(xì)胞亞群

與急性感染或接種疫苗后初始CD8+T細(xì)胞活化成為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生有效的免疫應(yīng)答并形成免疫記憶不同，慢性感染或腫瘤患者體內(nèi)的T細(xì)胞因持續(xù)暴露于抗原或炎癥信號，CD8+T細(xì)胞常呈現(xiàn)耗竭狀態(tài)（Tex細(xì)胞），主要表現(xiàn)為逐漸喪失免疫效應(yīng)功能、持續(xù)高表達(dá)抑制性受體、代謝失調(diào)、無法形成免疫記憶和穩(wěn)態(tài)自我更新差，以及明顯改變了的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征[11]。

鑒于Tex細(xì)胞的異質(zhì)性，有研究者結(jié)合相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)衍變，確定了由Ly108［轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1（T cell factor 1，TCF1）表達(dá)的替代標(biāo)志物］和CD69（與細(xì)胞增殖負(fù)相關(guān)）定義的Tex細(xì)胞的4階段發(fā)育軌跡，即Tex祖細(xì)胞1（Ly108+CD69+，Texprog1）、Tex祖細(xì)胞 2（Ly108+CD69-，Texprog2）、Tex中間體細(xì)胞（Ly108-CD69-，Texint）和 Tex終末期細(xì)胞（Ly108-CD69+，Texterm）[12]。Texprog1受限于淋巴組織且呈靜止?fàn)顟B(tài)，其不能進(jìn)入血液循環(huán)，但可與Texprog2相互轉(zhuǎn)化；Texprog2可啟動細(xì)胞周期并能進(jìn)入血液循環(huán)，在細(xì)胞分裂及轉(zhuǎn)化為Texint過程中逐漸喪失TCF1表達(dá)，同時轉(zhuǎn)錄因子Tbet表達(dá)顯著上調(diào)；Texint與可進(jìn)入血液循環(huán)的真正的效應(yīng)T細(xì)胞較為相似，盡管在表觀遺傳方面并不相同；Texint在轉(zhuǎn)錄因子Tox的調(diào)控下最終轉(zhuǎn)化為Texterm，后者逐漸喪失免疫效應(yīng)功能[12]。在Ⅳ期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中使用T細(xì)胞受體αβ作為分子條碼，顯示血液循環(huán)中克隆擴(kuò)增的抗腫瘤CD8+T細(xì)胞表達(dá)免疫效應(yīng)功能的基因特征，而與之匹配的腫瘤浸潤性T細(xì)胞表達(dá)終末期耗竭的基因特征[13]，基本對應(yīng)于上述研究中的Texint和Texterm。

研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1信號通路可優(yōu)先擴(kuò)增具循環(huán)潛能的Tex細(xì)胞亞群，Texprog2和Texint的數(shù)量分別增加了17和10倍，且阻斷PD-1信號通路可促進(jìn)Texprog2轉(zhuǎn)化為Texint[12]。一項對基底細(xì)胞癌或鱗狀細(xì)胞癌患者在接受PD-1抑制劑治療前后的克隆T細(xì)胞動力學(xué)分析顯示，具有耗竭表型的CD8+T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增并非源自預(yù)先存在的腫瘤浸潤性T細(xì)胞，而是出現(xiàn)了新的腫瘤特異性T細(xì)胞的克隆替代[14]，這與阻斷PD-1信號通路后擴(kuò)增的新的Texint可轉(zhuǎn)化為Texterm的推演相符。

T細(xì)胞耗竭伴隨代謝失調(diào)，PD-1交聯(lián)會減弱磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的信號傳導(dǎo)，抑制有氧糖酵解；與此同時，腫瘤細(xì)胞與Tex細(xì)胞爭奪葡萄糖以啟動有氧糖酵解，并導(dǎo)致大量乳酸蓄積于腫瘤微環(huán)境，使Tex細(xì)胞進(jìn)一步耗竭[11]。阻斷PD-1信號通路可讓具有一定免疫效應(yīng)功能的Texint的葡萄糖攝取增加，滿足其增殖和恢復(fù)活力所需的生物能量需求，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)[12，15]。

CD8+T細(xì)胞耗竭是目前臨床上開展腫瘤免疫治療所遇到的主要問題，嚴(yán)重影響了通過阻斷PD-1信號通路治療腫瘤的臨床效果。通過轉(zhuǎn)錄/表觀遺傳TCF1-Tbet-Tox軸調(diào)控的Tex細(xì)胞的發(fā)育軌跡，可充分了解Tex細(xì)胞亞群的異質(zhì)性及其相關(guān)特征的動態(tài)變化情況。然而，新近研究認(rèn)為，調(diào)控Tex祖細(xì)胞向效應(yīng)樣T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的核心轉(zhuǎn)錄因子為BATF而不是Tbet[16-17]。總之，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄/表觀遺傳的方式，促進(jìn)Tex祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有一定免疫效應(yīng)功能的Texint，并使之較長時間地停留于此階段，或者避免嵌合抗原受體T細(xì)胞發(fā)生耗竭，更好地發(fā)揮CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤作用，是上述幾項研究開展的共同目的。

4 腫瘤微環(huán)境有助于穩(wěn)定Treg細(xì)胞的免疫抑制功能

隨著腫瘤免疫治療從最開始用于晚期腫瘤、術(shù)后輔助治療，逐步拓展至也用于術(shù)前新輔助治療，與此類治療相關(guān)的免疫相關(guān)不良事件越來越為人熟知，與之密切相關(guān)的Treg細(xì)胞受到臨床關(guān)注。Treg細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞中具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群，其主轉(zhuǎn)錄因子為叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），可識別自身抗原并形成免疫耐受，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[18]。

與CD8+T細(xì)胞活化后誘導(dǎo)表達(dá)CTLA-4不同，F(xiàn)OXP3+Treg細(xì)胞組成型表達(dá)CTLA-4，CTLA-4在Treg細(xì)胞發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[19]。Treg細(xì)胞可借助CTLA-4通過跨內(nèi)吞作用從樹突狀細(xì)胞表面去除CD80和CD86，從而移去T細(xì)胞活化所需的共刺激信號[19]。此外，CTLA-4可抑制PI3K-蛋白激酶B信號通路，以避免Treg細(xì)胞向致病性1型輔助性T細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化而引發(fā)自身免疫疾病[19]。腫瘤浸潤性Treg細(xì)胞同時高表達(dá)PD-1，與CTLA-4等抑制性免疫檢查點一起抑制PI3K-蛋白激酶B信號通路，抑制細(xì)胞增殖，維持Treg細(xì)胞免疫抑制功能的穩(wěn)定性[19]。

Treg細(xì)胞的免疫抑制功能可能被腫瘤細(xì)胞利用，從而逃避機體免疫監(jiān)視。對116份黑色素瘤樣本的分析證實，在存在極高腫瘤抗原負(fù)荷的情況下，黑色素瘤細(xì)胞可表達(dá)人白細(xì)胞抗原Ⅱ，向Treg細(xì)胞提呈腫瘤抗原，直接激活和擴(kuò)增Treg細(xì)胞，調(diào)控局部免疫抑制微環(huán)境，最終發(fā)生免疫逃逸[20]。

腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞由于細(xì)胞增殖的代謝需求，在腫瘤微環(huán)境中均可轉(zhuǎn)換為高度糖酵解代謝方式（Warburg反應(yīng)），但在葡萄糖攝取方面，腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)勝于CD8+T細(xì)胞[21]。相比之下，F(xiàn)OXP3+Treg細(xì)胞更能從氧化磷酸化中獲取能量，從而維持自身的免疫抑制功能[21]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞可通過上調(diào)甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的活性、協(xié)調(diào)脂質(zhì)合成而增強Treg細(xì)胞的功能，上調(diào)PD-1的表達(dá)，增強抑制性受體的信號傳導(dǎo)[22]。

在高度糖酵解導(dǎo)致的低葡萄糖、高乳酸水平的腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞能通過單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1主動攝取乳酸，促使活化T細(xì)胞核因子1移位進(jìn)入細(xì)胞核，從而上調(diào)PD-1表達(dá)，同時抑制效應(yīng)T細(xì)胞的PD-1表達(dá)[23]。此時，阻斷PD-1可激活表達(dá)PD-1的Treg細(xì)胞，導(dǎo)致免疫治療失敗，提示可同時將Treg細(xì)胞的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1作為干預(yù)靶點[23]。在呈低糖酵解狀態(tài)的腫瘤微環(huán)境中，阻斷CTLA-4可導(dǎo)致Treg細(xì)胞表型和功能不穩(wěn)定，產(chǎn)生干擾素-γ和腫瘤壞死因子，增強腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示CTLA-4抑制劑聯(lián)用特異性腫瘤有氧糖酵解抑制劑能提高對高度糖酵解腫瘤免疫治療的效果[24]。

5 展望

腫瘤免疫治療借助機體免疫反應(yīng)清除腫瘤細(xì)胞，腫瘤免疫治療藥物的作用機制遠(yuǎn)較激酶抑制劑等腫瘤靶向治療藥物復(fù)雜。參與腫瘤免疫治療的樹突狀細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中各有各的作用，人為阻斷免疫檢查點進(jìn)行干預(yù)必然會對機體免疫穩(wěn)態(tài)造成不同程度的影響。腫瘤免疫治療過程中伴隨發(fā)生的免疫相關(guān)不良事件可能與外周Treg細(xì)胞消耗或其免疫抑制功能減弱相關(guān)，這在臨床上使用可介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody-dependent cytotoxicity，ADC）的CTLA-4抑制劑伊匹木單抗治療時表現(xiàn)得尤為明顯[25]。在伊匹木單抗單藥用于黑色素瘤術(shù)后輔助治療的Ⅲ期臨床試驗中，高達(dá)54%的患者發(fā)生了3～5級治療相關(guān)不良事件，使之臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重限制[26]。而另一個無ADC效應(yīng)的CTLA-4抑制劑曲美木單抗單藥治療黑色素瘤等的臨床試驗均以失敗告終，提示阻斷CTLA-4的治療機制比較復(fù)雜且存在不確定性。阻斷PD-1可導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的早期活化和增殖，臨床上觀察到小部分晚期胃癌患者治療期間出現(xiàn)腫瘤超進(jìn)展現(xiàn)象，提示阻斷PD-1對CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的相對影響可能在決定臨床療效方面起著重要作用[27-28]?？傊?，對于阻斷CTLA-4、PD-1等免疫檢查點進(jìn)行持續(xù)、深入的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，有助于實現(xiàn)腫瘤免疫治療的精準(zhǔn)化和個體化，在提高臨床療效的同時減少免疫相關(guān)不良事件的發(fā)生，更好地改善患者的預(yù)后。