PCR 技術(shù)及其在食品微生物檢測中的運用策略

◎薛 磊

（山西開放大學(xué)，山西 太原 030000）

當(dāng)前，我國的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，為了滿足消費需求，市場中的食品類型越來越多樣化。為了保障食品安全，必須強(qiáng)化食品質(zhì)量安全檢測工作，而食品微生物含量檢測是食品檢測工作中的重要組成部分，因為諸多食物腐爛變質(zhì)的原因就在于微生物含量超標(biāo)，一旦食用，極易損害人體健康，甚至威脅生命，所以必須針對食品微生物進(jìn)行有效檢測。在此過程中建議應(yīng)用PCR 技術(shù)，因為其具有高效性和準(zhǔn)確性的特點，可以有效提升食品微生物檢測工作的質(zhì)量和效率[1]。

1 PCR 技術(shù)

1.1 概念和原理

PCR 技術(shù)誕生于1985 年，一經(jīng)問世即成為基因工程中的主要技術(shù)手段之一，食品微生物檢測工作也因此更加便捷和有效。當(dāng)前，我國對于PCR 技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)發(fā)展至針對各類日常食品的微生物含量進(jìn)行檢測。PCR 技術(shù)的基本原理如下：在PCR 體系下加熱食物，如果食物中含有微生物，則相應(yīng)的核酸序列能夠受到溫度變化影響，出現(xiàn)變形情況。通常情況下，PCR 體系投入應(yīng)用的初始階段，可以將其溫度調(diào)節(jié)至94 ℃，微生物DNA 能在此溫度環(huán)境下裂解成為單鏈，但是需要注意對PCR 體系中的溫度進(jìn)行合理控制，若溫度過高，則會直接殺死微生物。在微生物DNA 裂解成為單鏈以后，再進(jìn)行降溫處理，將PCR 體系溫度調(diào)節(jié)至55 ℃，之后再調(diào)節(jié)至72 ℃，使引物與模板DNA 結(jié)合，DNA 聚合酶則可合成新DNA 鏈，之后反復(fù)進(jìn)行上述步驟，確認(rèn)檢測對象中有無特異性DNA 片段，即可確定食品中有無微生物以及微生物含量。同時，特異性引物只能在微生物上生長，且檢測便捷性大于微生物，所以應(yīng)用PCR 技術(shù)的便捷性和準(zhǔn)確性均更高[2]。

1.2 原料

在應(yīng)用PCR 技術(shù)的過程中，需要應(yīng)用的原料主要包括引物、dNTPs、DNA 聚合酶、緩沖液、Mg++、核酸模板。

2 以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法

PCR 技術(shù)當(dāng)前已經(jīng)在食品微生物檢測工作中得到了廣泛應(yīng)用，可針對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種微生物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，還可對食品樣品中的物質(zhì)進(jìn)行微量檢測工作，可精確至1 pg[3]?？梢奝CR 技術(shù)在食品微生物檢測中，能夠呈現(xiàn)較高的應(yīng)用價值。以此為基礎(chǔ)，將PCR 技術(shù)實際應(yīng)用于食品微生物檢測工作中，可以根據(jù)其主要形式劃分為不同的檢測方法。

2.1 常規(guī)PCR 檢測法

將目標(biāo)物質(zhì)相應(yīng)的DNA 模板以及引物混合，再加入適量聚合酶。在適宜的溫度環(huán)境和催化條件下，聚合酶可以加速目標(biāo)物質(zhì)DNA 模板序列的擴(kuò)增，經(jīng)過數(shù)次DNA 復(fù)制，即可獲取DNA 片段，且這一DNA 片段即循環(huán)DNA 模板，可繼續(xù)復(fù)制和擴(kuò)增。將目標(biāo)物質(zhì)放大以后，針對其中的特定DNA 開展標(biāo)記測定工作，即能夠獲取物質(zhì)中的微生物含量。

2.2 多重PCR 檢測方法

將多個模板與多條引物混合于同一反應(yīng)體系中，并分別進(jìn)行特異擴(kuò)增，形成不同的目的條帶，或是單一模板DNA 與多條引物在一個反應(yīng)系統(tǒng)中，針對同一模板中的不同片段進(jìn)行擴(kuò)增，也可針對超長片段實施擴(kuò)增處理[4]。相對于常規(guī)形式的PCR 檢測方法，其能夠呈現(xiàn)產(chǎn)物特異性高、擴(kuò)增效率高以及經(jīng)濟(jì)簡便等優(yōu)勢，適用于食品檢測工作中多種致病菌的檢測。

2.3 PR-PCR 檢測方法

該檢測方法屬于常規(guī)PCR 檢測方法的變形，首先針對檢測目標(biāo)中的一條RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄并獲取能夠與其互補的DNA，然后將DNA 鏈作為模板，使用常規(guī)PCR 技術(shù)擴(kuò)增復(fù)制DNA。在這一過程中，難點為RNA的逆轉(zhuǎn)錄，必須保障RNA 模板處于完整狀態(tài)，并且其中不可含有雜質(zhì)（如DNA、蛋白質(zhì)等）[5]。

3 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

PCR 技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高的特點，因此得到了迅速發(fā)展。同時，應(yīng)用范圍不斷得到拓展，不僅能夠在基因篩選、基因克隆、制備特異探針和基因表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行應(yīng)用，而且當(dāng)前已在農(nóng)業(yè)科學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、考古學(xué)以及環(huán)境科學(xué)等多個領(lǐng)域受到了充分重視。例如，將PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測工作中，能夠起到較好的應(yīng)用效果。

3.1 食品樣品致病菌檢測

開展食品樣品致病菌檢測工作時，若應(yīng)用傳統(tǒng)方法，不僅過程煩瑣，而且局限性顯著，需要首先富集培養(yǎng)被檢測微生物，直至其數(shù)量增長至可檢測水平，方可分離微生物，并針對其形態(tài)特征進(jìn)行觀察，最后開展生理化鑒定。同時，對于人工培養(yǎng)難度較大的微生物來說，應(yīng)用傳統(tǒng)樣品難以有效開展檢測工作。在細(xì)菌中，編碼rRNA 的基因具有較強(qiáng)的保守性，當(dāng)應(yīng)用PCR 技術(shù)時，其中的DNA 片段可以適當(dāng)擴(kuò)張，也就可以對樣品中的細(xì)菌及致病菌進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的檢測，即使針對人工無法培養(yǎng)的各種微生物，也可起到良好的檢測效果。在應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測食品樣品致病菌時，需要針對靶DNA 進(jìn)行抽提，采用過濾或者離心的方式獲取樣品中的細(xì)菌細(xì)胞，再裂解細(xì)胞，實施核酸純化，使其適用于PCR 技術(shù)，即可開展檢測工作。

3.2 乳酸菌檢測

可以產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌均可被稱為乳酸菌，當(dāng)前多數(shù)乳酸菌屬于有益菌，可起到促進(jìn)胃腸消化、優(yōu)化腸道功能和降低血清膽固醇含量等多方面作用，有利于提升機(jī)體免疫力和維持人體健康，但是有少數(shù)乳酸菌會對人體產(chǎn)生危害，所以購買食物時，消費者會仔細(xì)查看食品乳酸菌含量，所以需要準(zhǔn)確檢測食品中的乳酸菌含量。

我國針對乳酸菌檢測工作的研究開展時間較早，當(dāng)前已經(jīng)可以明確，乳酸菌DNA 序列1 414～1 432位置上的21 個堿基排列具有顯著代表性，并且多種類型的乳酸菌具有這一堿基排列，目前可以確認(rèn)包含雙歧桿菌在內(nèi)的32 類乳酸菌均是如此。所以，針對乳酸菌含量開展檢測工作的主要內(nèi)容，即為針對上述的21 個堿基排列進(jìn)行檢測，獲取這一序列時，應(yīng)該使用SDS 方法裂解乳酸菌細(xì)胞，再借助蛋白酶去掉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，即能獲取乳酸菌核酸，且可保障其完整性，之后提取所需的基因片段并對相應(yīng)的引物進(jìn)行研究。因為這一片段為乳酸菌特有的類型，所以引物不會與其他物質(zhì)結(jié)合，也就可以對乳酸菌含量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測[6]。

3.3 生活飲用水細(xì)菌檢測

飲用水水質(zhì)檢測工作內(nèi)容主要為檢測大腸桿菌類以及人類糞便污染的大腸桿菌。傳統(tǒng)的檢測方式需要共同培養(yǎng)細(xì)菌與將要進(jìn)行檢測的可以利用乳糖的革蘭氏陰性菌，整體過程較為煩瑣，耗費時間長。若能利用-半乳糖苷酶，則可使用明確的底物開展檢測工作，更有利于提升檢測效率。但是，部分大腸桿菌不能對-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行表達(dá)，所以檢測必然存在一定的失敗概率，導(dǎo)致檢測工作的效率受到影響。應(yīng)用PCR技術(shù)開展-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因檢測工作，其中的靈敏性和特異性可得到顯著提升。由于PCR 技術(shù)可以起到擴(kuò)增-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因的作用，能夠從水樣中分別檢測到大腸桿菌類以及大腸桿菌。通常情況下，選擇應(yīng)用經(jīng)過擴(kuò)增的-半乳糖苷酶為活體開展培養(yǎng)工作，可以同時檢測到同一類型的大腸桿菌類，而使用經(jīng)過擴(kuò)增的-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行檢測，則可檢測出一種大腸桿菌以及志賀氏菌。另外，應(yīng)用PCR 技術(shù)，僅需數(shù)小時即可完成檢測工作，準(zhǔn)確性和效率較高[7]。

3.4 啤酒腐敗菌檢測

當(dāng)前，我國啤酒產(chǎn)量大且種類多，市場廣闊，啤酒生產(chǎn)過程中需要發(fā)酵，且乳酸桿菌在其中占據(jù)重要地位。與此同時，啤酒花中含有異A 酸，其能起到抑菌作用，能夠?qū)θ樗峋a(chǎn)生一定的影響。根據(jù)相關(guān)研究顯示，乳酸桿菌之所以能起到抑制異A 酸生長的作用，原因在于其中含有horA 基因，這一基因易引起啤酒變質(zhì)，即horA 基因能夠?qū)ζ【苹óa(chǎn)生抗性。啤酒敗菌檢測方法是以horA 基因順序為基礎(chǔ)合成相應(yīng)的特異性產(chǎn)物，再加入DNA 聚合酶以及乳酸桿菌DNA提取液，通過電泳檢測混合產(chǎn)物的檢測方法。應(yīng)用這一方法檢測啤酒中的腐敗菌，僅需耗時6 h，相對于傳統(tǒng)模式下的檢測,效率顯著提升。

4 結(jié)語

一直以來，食品安全問題是我國社會發(fā)展過程中的重點問題，所以必須重視食品檢驗檢測工作PCR 技術(shù)具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)勢，在食品微生物檢測中的應(yīng)用效果良好，未來仍需積極推動該技術(shù)發(fā)展，以促使我國食品安全監(jiān)管工作水平的不斷提升。