微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌免疫檢查點抑制劑療效預測標志物研究進展

王志強，東帥，李夢龍，梁銳

0 引言

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）可以解除免疫檢查點的“免疫剎車”作用，使免疫系統(tǒng)能夠識別并殺傷腫瘤細胞。根據(jù)作用位點的不同，常用的ICIs可分為PD-1單抗、PD-L1單抗和CTLA-4單抗三類。ICIs對存在錯配修復基因缺陷（deficient mismatch repair,dMMR）或微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability high,MSI-H）的結(jié)直腸癌患者治療效果確切。也有研究發(fā)現(xiàn)，部分錯配修復基因無缺陷（proficient mismatch repair,pMMR）或微衛(wèi)星穩(wěn)定型（microsatellite stability,MSS）結(jié)直腸癌患者也能從ICIs的治療中獲益[1-2]，如何篩選出能夠從ICIs治療獲益的MSS結(jié)直腸癌患者成為當前研究的熱點。

通過預測標志物的檢測可以發(fā)現(xiàn)潛在的對ICIs治療有效的微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌患者，擴大免疫治療獲益人群。在MSS結(jié)直腸癌患者ICIs療效預測方面，部分標志物已經(jīng)顯示出較好的潛能和價值。本文將對微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌ICIs療效預測標志物的相關研究進行全面梳理和總結(jié)，為MSS結(jié)直腸癌患者免疫治療提供參考。

1 基因水平預測標志物

1.1 腫瘤突變負荷

腫瘤突變負荷（tumor mutational burden,TMB）是指基因組每百萬個堿基發(fā)生的體細胞基因突變個數(shù)。

KEYNOTE158研究采用帕博利珠單抗治療非結(jié)直腸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高TMB患者客觀緩解率顯著高于低TMB患者（29%vs.6%）[3]。因此，美國FDA批準了帕博利珠單抗用于腫瘤組織存在高TMB（≥10 mut/Mb）的難治性進展期實體瘤的治療。MSS結(jié)直腸癌是實體瘤的一種，其腫瘤組織中的TMB同樣能夠?qū)ε敛├閱慰沟寞熜нM行預測。

在結(jié)直腸癌中，高TMB結(jié)直腸癌患者中僅有16%的患者為MSI-H型，其余84%的結(jié)直腸癌患者為MSS型，這些高TMB MSS結(jié)直腸癌患者可以從ICIs治療中獲益[4-5]。Fabrizio等[6]研究發(fā)現(xiàn)TMB對ICIs治療結(jié)直腸癌療效預測方面優(yōu)于MSI狀態(tài)檢測，以上這些研究均表明TMB是預測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效標志物。目前，研究者對TMB臨界值的設定并未達成共識，常用的臨界值有10、16、20 mut/Mb。

1.2 POLE/POLD1基因突變

DNA聚合酶ε（DNA polymerase epsilon,POLE）和δ（DNA polymerase delta 1,POLD1）基因編碼DNA聚合酶的核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，參與DNA的復制和校對，當POLE/POLD1基因發(fā)生突變時，DNA復制受到直接影響。皮膚癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤均可發(fā)生該基因突變，在結(jié)直腸癌中約有1%的患者存在POLE/POLD1突變，且多見于年輕的右半結(jié)腸癌患者，POLE/POLD1突變與MSI突變相互排斥，因此主要存在于MSS結(jié)直腸癌患者中[7]。POLE/POLD1突變的腫瘤組織中存在大量細胞毒性T細胞（CD8+）和記憶T細胞（CD45RO+），并且存在較高水平的突變新抗原[8]。

相關研究表明，在非小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌和其他實體瘤治療中POLE/POLD1突變能夠?qū)CIs療效進行預測[9-11]。在MSS mCRC治療中，POLE/POLD1突變對ICIs療效的預測價值也已經(jīng)得到證實，多個研究結(jié)果顯示使用帕博利珠單抗治療存在POLE/POLD1突變的MSS轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌效果顯著[12-13]，表明POLE/POLD1突變是預測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效標志物。

1.3 結(jié)直腸癌分子亞型

根據(jù)基因表達特點國際結(jié)直腸癌分型聯(lián)盟將結(jié)直腸癌分為4種共識分子亞型（consensus molecular subtypes,CMS）：CMS1型：免疫型，以高TMB和突變新抗原、高度免疫細胞浸潤以及BRAF V600E突變?yōu)樘卣鳎琈SI狀態(tài)多數(shù)為dMMR/MSI-H。CMS2型：經(jīng)典型，其特征是WNT和MYC通路激活，該亞型中MSI-H的患者比例很低，不超過2%。CMS3型：代謝型，其特征是癌細胞代謝失調(diào)和KRAS突變。CMS4型：間質(zhì)型，其特征是基質(zhì)浸潤、轉(zhuǎn)化生長因子β激活和血管生成[14]。CMS1和CMS4型腫瘤組織中均存在高度的免疫細胞浸潤，有可能從免疫療法中獲益，是潛在的免疫治療療效預測標志物。但是CMS1和CMS4型免疫微環(huán)境是截然不同的，CMS1表現(xiàn)為免疫活化狀態(tài)，CMS4表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)。

CMS1型腫瘤組織中存在CD8+T細胞和CD68+巨噬細胞浸潤，而且與腫瘤發(fā)生免疫逃避相關的免疫檢查點分子CTLA-4、PD-1和PD-L1表達升高[15]。有研究采用恩考芬尼（BRAF抑制劑）、西妥昔單抗（EGFR抑制劑）聯(lián)合納武單抗治療MSS型BRAFV600E突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，入組患者分子亞型均為CMS1型，BRAF抑制劑與EGFR抑制劑聯(lián)合誘導出短暫的MSI-H表型，從而提高了PD-1抗體的反應率[16]，表明CMS1型MSS結(jié)直腸癌患者采用ICIs與靶向藥物聯(lián)合治療效果較好。

CMS4型的免疫浸潤模式與CMS1型不同，主要是存在抑制性的髓源性抑制細胞（myeloidderived suppressor cells,MDSCs）、調(diào)節(jié)性T細胞（T regulatory lymphocytes,Tregs）、單核細胞源性細胞和Th17細胞浸潤。在腫瘤組織中免疫抑制因子TGF-β和CXCL12與趨化因子白細胞介素17和23表達上調(diào)[17]。當前有多個研究結(jié)果顯示，CMS4型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者采用ICIs治療效果并不理想[18-19]。

1.4 甲基化

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）是烷化劑誘導的DNA損傷修復機制中的關鍵蛋白，MGMT甲基化的膠質(zhì)瘤患者采用替莫唑胺治療療效較好[20]。約有40%的結(jié)直腸癌患者存在MGMT甲基化，但是單獨采用替莫唑胺治療MGMT甲基化的結(jié)直腸癌患者效果不佳[21]。

MAYA研究采用替莫唑胺序貫ICIs治療MGMT甲基化的MSS轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，結(jié)果顯示在接受替莫唑胺治療2個療程后疾病穩(wěn)定、獲得后續(xù)納武單抗聯(lián)合伊匹單抗治療的33位患者中，客觀緩解率為45%，中位OS和PFS分別為18.4和7個月[22]。提示使用替莫唑胺能夠誘導并獲得超突變表型，具有將冷腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮[瘤的療效。同時也說明ICIs對MGMT甲基化的MSS mCRC具有較好的療效，MGMT甲基化具有作為MSS結(jié)直腸癌ICIs療效預測標志物的潛能。

2 蛋白水平預測標志物

2.1 PD-1和PD-L1的表達

程序性死亡受體1（PD-1）是一種跨膜蛋白，表達于活化的T細胞、B細胞和自然殺傷細胞表面。程序性死亡配體1（PD-L1）是PD-1的配體，通常在腫瘤細胞表面表達[23]，此外腫瘤免疫微環(huán)境中的淋巴細胞、巨噬細胞和間質(zhì)細胞等也會表達PD-L1。PD-1與PD-L1結(jié)合能抑制效應T細胞的增殖和功能，促進效應T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細胞的凋亡，從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊[24]。

PD-L1表達水平通常采用綜合陽性評分（combined positive score,CPS）、腫瘤細胞陽性比例評分（tumor cell proportion score,TPS）或免疫細胞陽性比例評分（immune cell proportion score,IPS）來評價，在胃癌、非小細胞肺癌以及食管癌中采用上述評分系統(tǒng)能夠?qū)CIs療效進行預測[25]。但在結(jié)直腸癌中，PD-L1的表達水平與dMMR/MSI-H并不存在相關性，采用PD-L1單項指標不能預測ICIs的療效[26]。

Llosa等[27]發(fā)現(xiàn)MSS mCRC患者的腫瘤組織高表達PD-L1同時腫瘤中存在PD-1高表達的T細胞（CD8+）浸潤時，腫瘤免疫微環(huán)境與dMMR/MSI-H患者類似，患者能夠從帕博利珠單抗治療中獲益。提示聯(lián)合檢測腫瘤組織PD-L1表達水平和PD-1高表達T細胞能夠預測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效。

2.2 突變新抗原

突變新抗原（mutation-associated neoantigens,MANA）存在于癌細胞表面，能夠被樹突狀細胞遞呈給免疫效應細胞，引起腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）細胞的浸潤[28]，因此，T細胞對MANA的識別與ICIs的療效相關。

存在高水平MANA的肺癌和黑色素瘤患者采用ICIs治療的效果較好[9,29-30]。Luksza等[31]為了更好的預測ICIs的療效建立了突變新抗原模型，通過該模型可以預測ICIs治療肺癌和黑色素瘤患者的療效。在當前的結(jié)直腸癌臨床研究中通常同時檢測MANA、TMB和TILs水平以評價ICIs療效，MANA具有作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預測標志物的潛能。

2.3 T細胞受體庫

T細胞受體（T cell receptor,TCR）由4條多肽鏈組成，包括α、β、γ和δ，編碼4條多肽鏈的TCR基因發(fā)生重排使TCR具有多樣性和特異性。因此，研究者根據(jù)TCR基因的特異性建立了T細胞受體庫。研究表明腫瘤微環(huán)境中T細胞受體庫呈現(xiàn)多樣化時免疫治療療效更好[32]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在治療前可以采用液體活檢方法檢測T細胞受體庫對ICIs的療效進行預測[33]。

Chen等[34]對TCR多樣性在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者療效預測方面的價值進行了評估，發(fā)現(xiàn)TCR多樣性水平高或化療后TCR多樣性快速下降的患者治療效果更好。另一項采用腫瘤疫苗聯(lián)合奧沙利鉑治療進展期結(jié)直腸癌的研究結(jié)果顯示，TCR多樣性評分高的患者具有較好的療效[35]。這些研究提示T細胞受體庫可能是結(jié)直腸癌ICIs治療療效潛在的預測標志物，確切結(jié)論尚需進一步研究證實。

3 腫瘤微環(huán)境預測標志物

腫瘤微環(huán)境（TME）是指腫瘤癌巢和間質(zhì)中存在的免疫細胞、間質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)及活性介質(zhì)。TME在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，目前發(fā)現(xiàn)多種免疫治療標志物與腫瘤微環(huán)境有關。

3.1 腫瘤浸潤性淋巴細胞和免疫評分

在腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)中通常存在多種淋巴細胞的浸潤，這些淋巴細胞統(tǒng)稱為TILs，TILs包括T細胞、B 細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等多個亞群，是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分。

在結(jié)直腸癌組織中出現(xiàn)細胞毒性T細胞和Th1細胞的浸潤以及IFN-γ表達上調(diào)時提示ICIs的療效較好，表明TILs能夠?qū)γ庖咧委煹寞熜нM行預測[36]。有研究表明，在抗PD-1抗體治療有效的乳腺癌和膀胱癌組織中CD8和PD-L1的表達水平顯著升高[37-39]。當前，PD-L1陽性細胞和CD8+T細胞共同浸潤已經(jīng)用于ICIs治療結(jié)直腸癌等腫瘤療效的預測[40-41]。以上這些研究表明，TILs具有作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預測標志物的潛能。

為了更精確對ICIs的療效進行預測，研究者提出了根據(jù)TILs的分布進行免疫評分的方法，該方法對位于腫瘤核心區(qū)域及交界區(qū)域中的CD8+T細胞、CD3+T細胞和CD45RO+記憶性T細胞的數(shù)量進行分級。將兩個區(qū)域內(nèi)淋巴細胞群的密度從低到高評為1～4分[42]。目前，有多個研究采用免疫評分系統(tǒng)對ICIs療效進行預測[43-45]。免疫評分能否作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預測標志物尚需更多的證據(jù)加以證實。

3.2 腸道和腫瘤菌群

在宿主免疫系統(tǒng)的維持和發(fā)展過程中腸道菌群起著重要作用，ICIs治療腫瘤的療效與腸道菌群有關[46-47]。一項研究表明，胃腸腫瘤患者腸道的普氏桿菌與擬桿菌屬的比例與ICIs療效相關，患者能從免疫治療中獲益很可能與細菌代謝產(chǎn)物有關[48-49]。另一項研究顯示，從人腸道微生物群中收集的含有11種細菌的菌群，在小鼠腸道中能夠誘導出產(chǎn)生干擾素γ的CD8+T細胞，從而增強了ICIs的抗腫瘤療效[50]。

除了腸道菌群外，結(jié)直腸腫瘤組織內(nèi)也存在菌群。其中關于具核梭桿菌的研究較多，該菌是結(jié)直腸癌中一種腫瘤駐留菌。相關研究表明，具核梭桿菌能夠激活干擾素刺激因子信號通路，進而誘導PD-L1表達并增加IFN-γ+CD8+TILs的浸潤，從而提高腫瘤對ICIs的敏感度，當腫瘤組織中存在高水平具核梭桿菌時，患者ICIs的治療效果好，且不需檢測MSI狀態(tài)[51]。提示具核梭桿菌可以對包括MSS在內(nèi)的結(jié)直腸癌ICIs療效進行預測。

4 結(jié)語

免疫檢查點抑制劑在MSI-H結(jié)直腸癌治療中顯示出的良好療效讓研究者認識到免疫治療所蘊含的巨大潛力和價值。目前研究者正在試圖通過篩選ICIs預測標志物、開發(fā)新的ICIs藥物以及將ICIs與化療、放療或靶向治療聯(lián)合使用來提高MSS結(jié)直腸癌的治療效果，從而獲得最佳的MSS結(jié)直腸癌免疫治療方案。其中，TMB、POLE/POLD1基因已顯示出對MSS結(jié)直腸癌ICIs療效具有較好的預測作用。除了本文中的標志物以外，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）也能對MSS結(jié)直腸癌ICIs的療效進行較好的監(jiān)測，ctDNA水平較低的患者疾病穩(wěn)定，ctDNA升高的患者通常會出現(xiàn)快速進展[52]。

然而，現(xiàn)有的ICIs療效預測標志物還存在一些問題：（1）用于MSS結(jié)直腸癌預測的相關研究較少，需要更多的臨床研究進行驗證。（2）TMB、TILs等預測標志物的臨界值尚未形成共識，需要進一步明確。相信隨著對免疫系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)機制的不斷深入了解、免疫治療理念的逐步發(fā)展和完善，免疫檢查點抑制劑在MSS結(jié)直腸癌的應用將更加科學和規(guī)范。