經(jīng)典瞬時(shí)感受器電位通道對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖所引起的阻塞性病變的影響

閆文麗，唐學(xué)義，張曉宇

1.安陽市第六人民醫(yī)院呼吸危重癥科，河南 安陽 455000；

2.河南省人民醫(yī)院·鄭州大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450003

在全球每年死亡人數(shù)中，心血管疾病占1/3，我國(guó)心血管疾病死亡率也居高不下［1］。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中及心肌梗死等心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。怎么預(yù)防及治療心血管疾病，是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及探索其靶點(diǎn)非常重要。經(jīng)典瞬時(shí)感受器電位通道（TRPC）是Ca2+身體性非選擇性的陽離子通道，TRPC6能介導(dǎo)受體操縱的鈣流入，表達(dá)參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，尤其在心血管相關(guān)疾病的病理過程中有著重要作用［2］。本研究就TRPC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖所引起的阻塞性病變的影響進(jìn)行了探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 人體實(shí)驗(yàn) 選取尸檢標(biāo)本進(jìn)行研究，尸檢標(biāo)本選擇生前患有高血壓及腦血管疾病者。此次檢測(cè)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。尸檢標(biāo)本的尸解經(jīng)其家屬同意后實(shí)行。

1.1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 周齡為6周的、購(gòu)于北京維通利華公司的ApoE -/-小鼠為模型組，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)2周；購(gòu)于空軍軍醫(yī)大中心的C57BL/6J小鼠為對(duì)照組，經(jīng)普通飼料喂養(yǎng)12 周。ApoE -/-小鼠經(jīng)C57BL/6J 小鼠回交10 代以上做基因敲除。

1.2 方法

1.2.1 經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊中TRPC6 表達(dá)取頸動(dòng)脈分叉位置，血管壁出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化明顯的斑塊組織進(jìn)行檢測(cè)，并取其周圍血管壁病變不明顯的組織為對(duì)照組。去除殘留血液、石蠟包埋；制作切片；烘箱融化石蠟、甲苯、梯度乙醇水化；抗原修復(fù)；透膜、內(nèi)源過氧化氫酶滅活；封閉；孵育；顯色；蘇木素染色液復(fù)染；脫水等處理后，樹膠封片，顯微鏡拍照，取5個(gè)視野經(jīng)分析圖像計(jì)算平均光密度，取均值。

1.2.2 小鼠建模后于其腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉 將胸腹腔打開，灌注3～4 mL 生理鹽水至左心室至肝臟發(fā)白，隨脊柱分離主動(dòng)脈，一起剪下心臟，放入PBS 緩沖液干粉，顯微鏡下剝離心臟和血管組織，沿主動(dòng)脈根部剪下心臟，縱向剖開主動(dòng)脈為Y 型。把主動(dòng)脈放入4%多聚甲醛中24 h、油紅O 染液浸染4 h，再用異丙醇分化多次至動(dòng)脈粥樣硬化斑塊為紅色、動(dòng)脈壁為白色。經(jīng)蒸餾水沖洗后拍照，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)整個(gè)主動(dòng)脈面積中的斑塊面積占比。另外經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的TRPC6 表達(dá)?；蚯贸螅?jīng)CD68 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中平滑肌細(xì)胞含量，經(jīng)天狼猩紅染色法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的膠原纖維含量。采用超聲影像技術(shù)檢測(cè)小鼠的頸部總動(dòng)脈情況。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）TRPC6 在頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)情況。（2）高脂飼養(yǎng)下的動(dòng)脈粥樣硬化形成情況。（3）TRPC6在小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)情況。（4）基因敲除后，動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的平滑肌細(xì)胞及膠原纖維含量情況。（5）基因敲除后，血管壁增厚及血流阻力情況。

2 結(jié)果

2.1 石蠟切片中的IHC染色結(jié)果

動(dòng)脈粥樣硬化不明顯的血管中，其血管內(nèi)膜及中膜上均有TRPC6表達(dá)。而有明顯動(dòng)脈粥樣硬化的血管中，血管形態(tài)破壞改變，中膜變薄，血管內(nèi)斑塊組織較多，TRPC6表達(dá)顯著更高。經(jīng)Image-Pro Plus6.0 計(jì)算IHC 陽性染色平均光密度值顯示，動(dòng)脈粥樣硬化血管發(fā)生明顯的平均光密度為（0.006±0.001），未有明顯動(dòng)脈粥樣硬化平均光密度為（0.041±0.012），動(dòng)脈粥樣硬化血管發(fā)生明顯的顯著更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠

經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)12周后的小鼠動(dòng)脈上出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。說明高脂飼料喂養(yǎng)12 周后的小鼠建模成功。

2.3 IHC檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)IHC檢測(cè)法顯示，對(duì)照組小鼠血管壁上的TRPC6表達(dá)弱，模型組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有明顯的TRPC6 陽性顯示。經(jīng)軟件統(tǒng)計(jì)其陽性染色平均光密度值，模型組（0.004±0.010）高于對(duì)照組（0.063±0.012），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 基因敲除后結(jié)果

對(duì)小鼠進(jìn)行基因敲除后，經(jīng)CD68 抗體免疫染色評(píng)價(jià)出其巨噬細(xì)胞含量，經(jīng)α-SMA評(píng)價(jià)平滑肌細(xì)胞含量，經(jīng)天狼猩紅染色評(píng)價(jià)膠原纖維含量。巨噬細(xì)胞增多，平滑肌細(xì)胞、膠原纖維減少會(huì)提高動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性。模型小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞含量（16.55±1.12）顯著少于對(duì)照組（28.21±2.23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；平滑肌細(xì)胞（27.26±2.51）顯著高于對(duì)照組（20.92±1.61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而膠原纖維差異不明顯。結(jié)果提示，基因敲除后，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的斑塊穩(wěn)定性更高。

2.5 常規(guī)喂養(yǎng)的小鼠

常規(guī)喂養(yǎng)的小鼠頸動(dòng)脈血管舒張內(nèi)徑、血管收縮內(nèi)徑、血管壁厚度、血流阻力指數(shù)無明顯的差異。高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的動(dòng)脈血管舒張內(nèi)徑、血管收縮內(nèi)徑有明顯的縮小，血管壁厚度有明顯增厚，血流阻力指數(shù)有明顯升高，表明造模會(huì)引起頸動(dòng)脈血管功能障礙?；蚯贸笮∈蠛透咧∈蟊容^，頸動(dòng)脈血管舒張內(nèi)徑從（0.43±0.03）mm增大到（0.53±0.01） mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血管收縮內(nèi)徑從（0.36±0.02）mm 增大到（0.45±0.02）mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血管壁厚度從（0.012±0.012）mm 減小到（0.085±0.002）mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血流阻力指數(shù)從（0.890±0.012）mm降到（0.760±0.001） mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明基因敲除后，能明顯改善血管壁增厚及血流阻力情況。

3 討論

長(zhǎng)久以來，研究中針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化提出了多種病理相關(guān)學(xué)說，包括：炎癥、損傷反應(yīng)、內(nèi)皮功能紊亂、血栓形成等眾多學(xué)說［3］。目前對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病理學(xué)特征較統(tǒng)一的看法是膽固醇及急速的血湍流刺激動(dòng)脈血管造成血管的內(nèi)皮出現(xiàn)不同程度的損傷，大量的脂蛋白蓄積在內(nèi)皮下，堆積成了脂紋。外周單核細(xì)胞經(jīng)黏附、分化作用，形成了巨噬細(xì)胞，吸收脂蛋白產(chǎn)生了泡沫性細(xì)胞。而內(nèi)皮細(xì)胞的活化性及大量細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)平滑肌產(chǎn)生刺激增生，且細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)斑塊，其內(nèi)的細(xì)胞凋亡壞死［4］。

瞬時(shí)受體電位TRP初始應(yīng)用于1969年Manning對(duì)果蠅光轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體的研究中，光刺激影響果蠅突變體產(chǎn)生瞬時(shí)鈣濃度增加，并出現(xiàn)電位反應(yīng)［5］。其分為7 個(gè)亞家族，TRPC 是其中一個(gè)類似的蛋白家族，而TRPC 有7 個(gè)亞型，TRPC1-TRPC7，每個(gè)亞型都有6個(gè)跨膜區(qū)，5、6跨膜區(qū)間有孔環(huán)結(jié)構(gòu)，每4個(gè)成員可組成同源及異源四聚體，構(gòu)成TRPC 通道。TRPC1 常表達(dá)在哺乳動(dòng)作組織中；TRPC2 是人類假基因，表達(dá)于大鼠犁鼻器官及小鼠精子頭部神經(jīng)元微絨毛中；TRPC3表達(dá)于腦、卵巢、肺、腸、胎盤及睪丸中；TRPC5常表達(dá)于腦中；TRPC6多表達(dá)在肺中，其次是腦、卵巢、肌肉、胎盤中；TRPC7 表達(dá)在腦、肺、心、眼、睪丸中。TRPC 主要的激活方式有兩種，即受體操縱和庫操縱鈣內(nèi)流，以引起鈣濃度變化。受體操縱中，G蛋白偶聯(lián)受體及受體酪氨酸激酶受外源性刺激，募集磷脂酶C、水解磷脂酰肌醇、二磷酸，產(chǎn)生肌醇、二酰甘油、三磷酸，經(jīng)結(jié)合后引起鈣釋放進(jìn)入胞漿。DA直接激活TRPC引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流。庫操縱鈣內(nèi)流中，細(xì)胞內(nèi)鈣庫耗竭使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的STIM1 和細(xì)胞膜上Oriall 偶聯(lián)，激活TRPC 通道，促使外鈣出現(xiàn)內(nèi)流。臨床上大多研究均顯示，TRPC參與了人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及心血管系統(tǒng)疾病等多系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。

本文通過對(duì)尸檢標(biāo)本進(jìn)行研究，提示TRPC6參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程。有臨床研究指出，TRPC-1 及TRPG-6 在低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)有Ca2+升高現(xiàn)象，對(duì)肺動(dòng)脈血管的重建有重要的作用。研究還指出，低氧3 周會(huì)增強(qiáng)肺動(dòng)脈高壓的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC-l、TRPC-6表達(dá)，細(xì)胞外Ca2+通過TRPC通道使細(xì)胞內(nèi)流增加，升高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+［6］。而動(dòng)脈粥樣硬化明顯的斑塊組織中成分較復(fù)雜，包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。其中內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展各階段均有重要作用。對(duì)小鼠建模的進(jìn)一步研究顯示，高脂飼養(yǎng)的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展迅速，可誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行TRPC6免疫組織化學(xué)法，發(fā)現(xiàn)其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的TRPC6表達(dá)上升，與人頸動(dòng)脈的斑塊組織檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)果說明，尸檢和小鼠組織實(shí)驗(yàn)均顯示TRPC6參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。另外，小鼠基因敲除后，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞顯著減少，平滑肌細(xì)胞及膠原纖維明顯增多，使其斑塊穩(wěn)定性更高。

內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中有血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的參與。內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞是心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分，對(duì)其生理及病理功能作用較大。血管內(nèi)皮細(xì)胞具體是指血管內(nèi)膜表面細(xì)胞，連續(xù)覆蓋整個(gè)血管腔表面扁平細(xì)胞，是功能性界面，處于血液及組織分界面。參與血管收縮、舒張、凝血、血管生成、動(dòng)脈硬化、炎癥的病理過程。有研究顯示，TRPC-7 干擾對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)?？稍黾蛹?xì)胞的繁殖及遷移，對(duì)高糖引起的內(nèi)皮損傷起到了一定保護(hù)作用［7］。提示TRPC-7 參與了血管內(nèi)皮生理及病理過程。內(nèi)皮細(xì)胞不僅能起到機(jī)械屏障及信息傳遞作用，還可合成分泌血脂活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)血管環(huán)境，使其保持穩(wěn)定的收縮舒張，抑制平滑肌遷移及增生，保持血栓形成及纖溶蛋白溶解平衡。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，分泌炎性因子，誘導(dǎo)單細(xì)胞核黏于表面，浸潤(rùn)到內(nèi)皮下間隙。延遲的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋功能缺失，不僅促成了血管內(nèi)形成粥樣硬化斑塊，也是血管不良修復(fù)反應(yīng)的主要原因。部分早期研究中顯示，人肺臍動(dòng)脈、皮膚微血管及大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中均有TRPC 表達(dá)。研究說明TRPC 參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及凋亡過程。血管內(nèi)皮具有血液流動(dòng)和溶質(zhì)經(jīng)半通透性血管內(nèi)皮層的調(diào)節(jié)功能。如血管出現(xiàn)炎癥，會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變及收縮，促使內(nèi)皮的通透性程度。TRPC本身具有調(diào)節(jié)鈣離子流的作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性產(chǎn)生著影響。人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后，其TRPC表達(dá)上調(diào)。TNF-α刺激肺動(dòng)脈、皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞，能顯著加倍提高凝血酶誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。同時(shí)，肌動(dòng)蛋白張力絲形成和跨內(nèi)皮單層電阻也會(huì)增加內(nèi)皮通透性。而皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞受TNF-α刺激影響TRPC 表達(dá)，內(nèi)皮屏障出現(xiàn)障礙，與TRPC 對(duì)鈣離子內(nèi)流調(diào)節(jié)時(shí)影響細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。因此，TRPC 的表達(dá)水平高低是內(nèi)皮細(xì)胞通透性信號(hào)表達(dá)的重要影響因素。TRPC 參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過大，會(huì)影響其生物學(xué)功能。NF-KB信號(hào)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，加速炎性、抗凋亡基因， RNA 抑制TRPC 表達(dá)，并影響凝血酶誘導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流情況，避免激活NF-KB。有研究顯示，受TRPC基因干擾后，凝血酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡為25%［8］。且經(jīng)基因微點(diǎn)陣分析顯示，內(nèi)皮細(xì)胞凝血酶誘導(dǎo)表達(dá)NF-KB 調(diào)節(jié)基因呈多倍增加，其中A20抗凋亡基因表達(dá)最高。

血管平滑肌細(xì)胞是血管重要成分，起著血管活性及構(gòu)型的重要作用。血管平滑肌細(xì)胞增殖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等血管疾病形成機(jī)制有著重要作用。在肺動(dòng)脈高壓患者和動(dòng)物模型中，其血管平滑肌細(xì)胞膜TRPC6表達(dá)顯著升高，并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞膜的增殖及侵襲。提示TRPC6可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞膜，對(duì)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡出現(xiàn)失衡，細(xì)胞基質(zhì)分泌使細(xì)胞、生長(zhǎng)因子介導(dǎo)血管的再塑，是造成肺動(dòng)脈高壓的主要原因。增殖和凋亡是相互對(duì)立制約的，兩者一起維護(hù)著機(jī)體組織器官各結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，一旦受多種內(nèi)外因素影響打破，會(huì)引起組織器官的增生、萎縮、重構(gòu)等病理現(xiàn)象。平滑肌細(xì)胞正常狀態(tài)下是靜止的非增殖狀態(tài)，起著調(diào)節(jié)血管張力的作用，胞質(zhì)內(nèi)有豐富肌絲。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷使胰島素類生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)調(diào)解素、內(nèi)皮衍生因子表達(dá)激活。上調(diào)平滑肌細(xì)胞增殖信號(hào)，下調(diào)抑制增殖信號(hào)，使其基因表達(dá)改變，改變中膜平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)入內(nèi)膜發(fā)生增殖，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，減少胞內(nèi)肌絲，平滑肌過度增殖，使其增殖與凋亡內(nèi)在平衡消失，進(jìn)而刺激動(dòng)脈收縮及狹窄，引起病理癥狀。本研究結(jié)果顯示，基因敲除后小鼠與高脂小鼠比較，頸動(dòng)脈血管舒張內(nèi)徑、血管收縮內(nèi)徑有明顯增大，血管壁厚度和血流阻力指數(shù)有明顯減小。說明TRPC6 基因敲除后，能明顯改善血管壁增厚及血流阻力情況。

綜上所述，TRPC6通過內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理發(fā)生、發(fā)展全過程，是其潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，可對(duì)此進(jìn)行深入研究。