纈草三酯的提純、成型工藝及其含量測定研究進展

＊曹井龍 薛慧 李艷楠 劉健 侯考爽 金成浩

（黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院 黑龍江 163319）

前言

蜘蛛香（Valeriana Jatamansi Jones）又名馬蹄香、小馬蹄香、臭藥、雷公七等，是敗醬科、纈草屬植物。蜘蛛香為多年生草本植物，具有理氣止痛、祛風除濕以及鎮(zhèn)驚安神等功效。蜘蛛香在我國有悠久的藥用歷史，其產量豐富，主要分布在我國西南地區(qū)[1]。蜘蛛香主要含有揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類和生物堿類等有效成分，2010年《中國藥典》中收錄蜘蛛香為中國傳統(tǒng)中藥，其一直被用于治療神經系統(tǒng)類疾病，如焦慮、失眠和抑郁等[2]。研究表明，從蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分中分離得到的纈草三酯具有良好的抗腫瘤活性，其相關作用機制和化合物的質量標準受到了廣大學者的關注[3]。在蜘蛛香的制備工藝中，當代新工藝提取純化技術，提高了中藥提取物的純度、收率，并降低了能耗、試劑用量。制劑工藝技術的提高，使提取物的物理化學性質更加穩(wěn)定，且生物利用度和存儲時間得到了提高與延長。綜上所述，纈草三酯的提取純化、成型工藝及藥理活性研究對其生產和進一步的藥物開發(fā)具有重要意義。

1.纈草三酯的提取純化工藝

隨著當代工業(yè)技術的發(fā)展和研究的不斷深入，研究人員已可從天然藥物中逐漸提取出多種單體成分，并對其在藥物開發(fā)和作用機制方面進行不斷探索和闡釋[4]?，F(xiàn)代高新提取技術與傳統(tǒng)的水煎煮、滲透、浸漬和水蒸氣蒸餾等提取方法相比，大大提高了提取效率和限度。尋找一種高效的方法將天然藥物的有效成分進行提取純化已成為重點關注內容。

纈草三酯為黃色油狀物，其密度與沸點分別為1.22g/cm3、525.9℃，易溶于甲醇、乙醇、DMSO等有機溶劑。在纈草三酯的提取研究中，羅喜榮等人[5]利用超臨界CO2萃取法將蜘蛛香粉末置于超臨界萃取器，提取產物溶解于甲醇溶液，并以甲醇做空白對照在256nm處測定其吸光值，最終通過響應曲面法得到不同提取工藝條件，其最佳萃取壓力、溫度和時間分別為30MPa、43.69℃、47.07min。該方法具有萃取高效、無溶劑殘留和步驟簡單等優(yōu)點。郜紅利等人[6]利用超聲輔助提取法將蜘蛛香粉末與乙醇混合后進行超聲提取，利用紫外分光光度法，將纈草三酯對照品與甲醇混合，依據不同濃度標準品的吸光值繪制標準計算曲線，計算提取物的質量濃度，并用Plackett-Burman試驗聯(lián)合星點設計效應面法得到不同提取工藝條件，其最佳乙醇體積分數、浸泡時間和超聲時間分別為65%、3h、30min，最終平均收率為4.37%。該方法具有重復性可靠和保持提取產物性質穩(wěn)定的優(yōu)點。李廣雷等人[7]通過石油醚滲漉法將蜘蛛香粗粉與石油醚混合進行萃取，萃取液回壓濃縮后進行硅膠柱層析和洗脫，利用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）法檢測提取物濃度，采用色譜方法和制備液相色譜法進行分離，其制備液相色譜最優(yōu)流動相比、進樣量和流速分別為甲醇-水（80:20）、1.0mL、20mL/min，最終得到98%純度的纈草三酯提取物。李廣雷等人通過硅膠的初步分離和液相色譜法純化使有機溶劑的用量大大減少，同時也減少硅膠對提取物的吸附。浦紹敬等人[8]通過超臨界萃取法將蜘蛛香切片粉碎后加入到萃取器中，調節(jié)萃取溫度和CO2流量，經過一級、二級和三級分離罐的連續(xù)萃取得到產物，將產物進行HPLC法純度分析和核磁共振波普儀結構分析，最終得到最佳萃取溫度、CO2流量和萃取時間分別為50～55℃、38～40kg/h、2h。該方法具有分離效果良好、提取效率增加及產物損耗減少等優(yōu)點。付洋等人[9]通過超聲提取法將蜘蛛香粉末與乙醇混合進行超聲提取，產物進行微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜法測定樣品含量，采用響應面法與熵權法繪制回歸方程得到不同提取條件，其最佳乙醇濃度、料液比和提取時間分別為50%～90%、35～65mL/g、20～40min。最終將響應面法與熵權法結合使蜘蛛香中的有效成分得到最大限度提取。綜上所述，超臨界CO2萃取法可有效避免纈草三酯在提取過程中的揮發(fā)，更有益于提取產物的穩(wěn)定，但因其試劑用量較大，不適合于大規(guī)模生產。

2.纈草三酯的成型工藝

成型工藝（Moulding process）是根據半成品的物理化學性質與醫(yī)療要求，將其制成能直接供臨床應用制劑的工藝過程。盡管天然藥物的提取純化技術已得到高度重視，但對其提取物的相關物理特性了解相對較少。大多數天然藥物提取物會出現(xiàn)一些問題，例如：易吸濕、易揮發(fā)、易熱不穩(wěn)定等，同時部分提取物會出現(xiàn)刺激性氣味。如何改善提取物的不良物理性能和掩蓋其刺激性氣味，對天然藥物的現(xiàn)代化發(fā)展至關重要[10]。

在纈草三酯的成型工藝中，魯文琴等人[11]利用固體自微乳法將提取后的纈草三酯與油酸乙酯、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（HS）和二乙二醇單乙基醚（Transcutol P）混合攪拌均勻，經過超聲處理后加入吸附劑（α-乳糖或β-環(huán)糊精）混合得到纈草三酯自微乳產物，并通過吸附能力檢測、休止角和卡爾指數等研究測定產物理化性質，最終得到最佳自微乳與β環(huán)糊精比例為1:5.714。該成型工藝技術使提取物口服利用度得到提高，但該制劑的穩(wěn)定性易受到高溫及光照等因素的影響，應低溫避光保存。劉開萍等人[12]將油酸乙酯、油相、乳化劑和助乳化劑混合，通過溶解度檢測和配伍試驗測定得到纈草三酯、油相、乳化劑和助乳化劑之間的最佳試劑配比，再將產物經過高速離心、強光照射和溫度變化等方法檢測該處方的穩(wěn)定性，最終最佳配伍試劑中油酸乙酯、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（HS）和二乙二醇單乙基醚（Transcutol P）的最佳比例分別為10%～30%、40%～80%、10%～53%。以上數據顯示，自微乳法可有效解決纈草三酯的水敏感性和難溶性問題，提高口服利用度和腸溶度，為自微乳在難溶性藥物中的應用提供了實驗依據。

3.纈草三酯的含量測定

中藥單體成分的含量測定作為質量控制指標之一，為中藥的應用提供數據支持和質量保障。由于中藥的成分過于復雜，且可能存在多種性質相似的同系物。隨著研究的不斷深入，已發(fā)展出多種精準的測定方法，但每種測定方法都存在相應的局限性，目前應用較多的測定方法為色譜法和分光光度法[13]。氣相色譜法可通過汽化測定樣品使其進入色譜柱，利用分子間作用力和流出時間不同進行樣品測定與分離。該方法具有高靈敏、高效率和高選擇等優(yōu)點，但受其檢測原理的限制，只能測定具有揮發(fā)成分的樣品。而高效液相色譜法是通過液壓差將測定樣品進入色譜柱，利用各組分極性的不同進行樣品測定與分離。該方法具有高分辨、高靈敏和高重復等優(yōu)點，但其分析成本較高，且價格及其維護費用昂貴。紫外-分光光度法通過利用相同物質的吸光值相同的特點，對測定樣品與標準品的吸光值進行比較分析。該方法具有高速率的優(yōu)點，但其檢測需要大量標準單品，且易受多種因素影響導致檢測結果不準確。為確保有效成分測定的高效和精準，需要根據不同的理化性質選用相應測定方法。

在纈草三酯的含量測定研究中，羅喜榮等人[14]通過分光光度法測定蜘蛛香中不同部位的纈草三酯含量，將蜘蛛香不同部位進行粉碎處理，用乙酸乙酯浸泡后進行超聲萃取并過濾，取纈草三酯標準品與待測樣品溶液在256nm波長處進行吸光度測定，繪制回歸方程計算出不同樣品的含量。結果表明，在蜘蛛香的不同部位中纈草三酯的含量存在顯著差異，在提高蜘蛛香的利用率方面，應以其根及根莖入藥為最佳。黃仁泉等人[15]通過高效液相色譜法測定不同種纈草的纈草三酯含量，將不同種纈草的根進行粉碎處理，甲醇溶液浸泡后進行超聲萃取并過濾，取樣品上清液與對照品進行色譜儀測定，繪制標準曲線計算出不同樣品的含量。結果表明，東北纈草和心葉纈草中纈草三酯的含量最高。因此為了提高提取產量，可優(yōu)先考慮以東北纈草和心葉纈草作為主要提取原料。袁秀芝等人[16]通過紫外-分光光度法測定不同產地纈草的纈草三酯含量，將不同產地的纈草進行粉碎處理，苯溶液浸泡后進行超聲萃取，取產物樣品與標準品分別溶于苯溶液進行吸光值測定，繪制回歸方程得出樣品含量。結果表明，湖北和貴州地區(qū)的纈草中纈草三酯含量最高。因此在纈草的用藥質量方面，可以考慮選擇湖北與貴州產地的纈草。崔亞君等人[17]通過雙波長薄層掃描法測定四川省不同種纈草的纈草三酯含量，將不同種纈草進行粉碎處理，用二氯甲烷浸泡后進行石油醚萃取，提取產物與苯溶液混合進行硅膠層析分離與薄層分離，將產物進行核磁共振氫譜檢測，繪制標準曲線計算樣品含量。結果表明，在四川省紅原地區(qū)的全葉纈草與石棉地區(qū)的蜘蛛香中纈草三酯的含量最高，為選取纈草三酯的提取原料提供了數據參考。以上研究方法可精準、高效地測定纈草三酯含量，為其質量標準測定方法的改良與優(yōu)化提供依據。

4.展望

隨著現(xiàn)代工業(yè)技術的發(fā)展，纈草三酯的提取效率與質量大幅提高，盡管目前對其提取純化技術的研究比較完善，但對于其成型工藝的研究卻相對缺乏，如果只是片面地追求纈草三酯的產物純度，有可能會導致產物的療效降低，還可能導致其副作用的增加，因為在提取純化過程中會出現(xiàn)溶劑殘留、刺激性氣味及性質改變等特殊問題。因此，優(yōu)化纈草三酯提純工藝技術的同時，也要注重纈草三酯成型工藝的技術研究，在了解其理化性質的基礎上，減少其毒副作用和特殊問題的發(fā)生。此外，含量測定方法的改良與優(yōu)化是提高產品純度與保障產品質量的先決條件，因此應不斷探索和改善纈草三酯的含量測定方法，為其日后開發(fā)與應用提供理論參考。