哮喘患兒Toll樣受體4基因多態(tài)性及其與哮喘發(fā)病的關(guān)系

楊雪嬌，白寶鑫，柯盈月

1 湖北省十堰市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北十堰 442000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是以氣道慢性炎癥為特征的一類異質(zhì)性疾病，發(fā)病與氣道高反應(yīng)性有關(guān)［1-3］。近年，我國兒童哮喘的發(fā)病率逐年增加［4-5］。研究［6-8］顯示，哮喘的發(fā)生發(fā)展可能與基因、環(huán)境因素密切相關(guān)。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是模式識別受體（PPRs）的一種，具有單個(gè)的跨膜蛋白，參與非特異性免疫（天然免疫）和特異性免疫［9-11］。TLR4是TLR家族成員之一，可識別細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖（LPS），參與調(diào)節(jié)人體Th1/Th2平衡，調(diào)控體內(nèi)血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）水平［12-13］，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。TLR4基因多態(tài)性可能從遺傳層面上決定不同個(gè)體對感染誘發(fā)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的差異性，最終影響疾病的發(fā)生。目前TLR4基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病的關(guān)系尚不明確。為此，我們分析哮喘患兒TLR4基因多態(tài)性，探討TLR4基因多態(tài)性與支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)系，旨在為兒童哮喘的診療提供新的思路。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年4月—2022年10月湖北省十堰市婦幼保健院收治的哮喘患兒172例（觀察組），其中男88例、女84例，年齡（8.3 ± 1.8）歲，BMI（8.3 ± 1.8）Kg/m2；均為漢族人群；根據(jù)≥6歲兒童哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重度分級［6］將哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度為輕度34例、中度35例、重度45例和危重58例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡6～14歲；②符合兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020年版）［14］診斷標(biāo)準(zhǔn)；③排除患惡性腫瘤、艾滋病、慢性肝腎疾病、自身免疫性疾病或入院前1個(gè)月內(nèi)接受免疫治療、抗炎治療及放化療的患者。另選擇同期在醫(yī)院兒童保健科門診體檢的兒童136例為對照組，對照組男65例、女71例，年齡（8.1 ± 1.5）歲，BMI（18.8 ± 3.2）Kg/m2，均為漢族人群。兩組性別、年齡、BMI等資料具有可比性。本研究通過十堰市婦幼保健院倫理委員會審查，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及材料 DNA提取試劑盒及PCR試劑盒購自購自寶生物工程（大連）有限公司，引物設(shè)計(jì)及合成購自上海生工生物工程公司。

1.3 兩組外周血TLR4基因檢測及分型 采集兩組外周靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）真空抗凝管。取細(xì)胞，按照DNA快速抽提試劑盒說明進(jìn)行操作，快速抽提全血基因組DNA，Nano-Drop分光光度計(jì)檢測提取樣本的吸光度值，A260/A280介于1.6～1.8，采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)檢測TLR4基因。共檢測TLR4基因2個(gè)SNP位點(diǎn)，其中Asp299Gly（A/G）上游引物5'-GATTACCATACTTAGACTACTACCTCCATC-3'，下 游 引物5'-GATCAACTTCTGAAAAAG CATTCCCAC-3'，引物長度249 bp，內(nèi)切酶Ncol；Thr399Ile（C/T）上游引物5'-GGTTCCTCTTCTCAAAGTGATTTTGGCAGAA-3'，下游引物5'-CCTCAACACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3'，引物長度406 bp，內(nèi)切酶Hinf-Ⅰ。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)判斷樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，比較用t檢驗(yàn)；應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析TLR4基因分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，χ2檢驗(yàn)分析樣本等位基因及基因型頻率分布差異，采用二元Logistic回歸分析不同TLR4基因位點(diǎn)基因型的兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)性，將TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)CC型賦值為1、CT型賦值為2、TT型賦值為3，計(jì)算哮喘發(fā)病的相對危險(xiǎn)度OR值。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點(diǎn)的SNPs的預(yù)期基因型頻率處于哈迪-溫伯格平衡（HWE），樣本具有群體代表性。觀察組TLR4基因Asp299Gly位點(diǎn)的基因型AA、AG、GG分別為67、74、31例，等位基因A、G分別為 208、136例，對照組分別為57、54、25、168及104例。兩組TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)Asp299Gly的基因型和等位基因頻率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為0.372、0.108，P均＞0.05）。觀察組TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)的基因型CC、CT、TT分別為31、73、68例，等位基因C、T分別為135、209例，對照組分別為42、60、34、144及128例。兩組TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)Asp299Gly的基因型和等位基因分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為10.19、11.501，P均＜0.05）。與對照組比較，觀察組TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)T等位基因分布頻率高（P＜0.05）。

2.2 不同TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)基因型兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)性 與CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點(diǎn)TT基因型兒童患哮喘的危險(xiǎn)性高［OR=2.353（95% CI1.575～4.663）；P＜0.05］；與CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點(diǎn)TT + TC基因型兒童患哮喘的危險(xiǎn)性高［OR=1.962（95% CI1.228～3.206）；P＜0.05］；與CT + CC基因型比較，TLR4 Thr399Ile位點(diǎn)TT基因型兒童的患病危險(xiǎn)性高［OR=1.875（95% CI1.258～3.059）；P＜0.05］。

3 討論

支氣管哮喘是兒童比較常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，哮喘的主要臨床表現(xiàn)為氣喘、呼吸急促、胸悶和咳嗽等呼吸道癥狀，并伴有可 變的呼氣氣流受限，影響兒童的生長發(fā)育。大量研究表明［15-16］，哮喘發(fā)病取決于各種易感基因與環(huán)境因素之間的相互作用，包括空氣污染、過敏原和遺傳變異更準(zhǔn)確地了解基因突變與哮喘之間的關(guān)聯(lián)有助于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和預(yù)防策略，從而降低重癥哮喘相關(guān)的發(fā)病率和病死率。

TLRs是一類跨膜模式識別受體發(fā)揮作用的非催化受體，在炎癥和腫瘤發(fā)生中起重要作用。目前在人類及哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)11個(gè)TLRs家族成員，其中了解比較清楚的是TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。TLR4基因位于染色體9q32-q33。TLR4作為跨膜受體，可通過識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs） 和損傷相關(guān)分子模式以及刺激下游信號通路導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的釋放來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。TLR4在宿主與入侵病原體和先天免疫之間的相互作用中起著至關(guān)重要的作用。TLR4識別細(xì)菌外膜中的脂多糖（LPS），LPS在調(diào)節(jié)包括哮喘在內(nèi)的氣道過敏性炎癥性疾病中起重要作用。TLR4通過觸發(fā)先天性和獲得性免疫來對抗細(xì)菌感染。TLR4在與LPS 結(jié)合后被激活，一系列下游磷酸化和去磷酸化事件最終導(dǎo)致調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄因子激活，包括干擾素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素，其還誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞成熟并促進(jìn) Th0 向Th1 轉(zhuǎn)變［17］?；罨腡LR4可以直接或間接影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，從而影響Th1/Th2 失衡，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生和發(fā)展，并影響患者體內(nèi)內(nèi)的細(xì)胞因子水平IL-4和IFN-γ水平。IL-4和IFN-γ是哮喘中免疫和炎癥反應(yīng)發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。IL-4主要由活化的Th2 細(xì)胞產(chǎn)生，對于驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞至關(guān)重要。Th2細(xì)胞釋放免疫球蛋白和IL-4，激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步降低Th1 細(xì)胞免疫反應(yīng)并減少IFN-γ分泌，從而削弱對Th2免疫反應(yīng)的抑制并導(dǎo)致慢性氣道炎癥［18-19］。IFN-γ是參與過敏性哮喘的主要促炎細(xì)胞因子，在中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞向肺部募集中起關(guān)鍵作用。因此，TLR4 在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是關(guān)于 TLR4 基因多態(tài)性與哮喘易感性的研究較少。

我們前期對172 例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的哮喘患兒的臨床資料展開研究。從基因水平檢測發(fā)現(xiàn)，TLR4 基因多態(tài)性位點(diǎn)Asp299Gly 的基因型和等位基因分布差異不明顯，未顯示出其于兒童哮喘的明顯相關(guān)性； Thr399Ile的基因型和等位基因分布在顯著差異，Thr399Ile 位點(diǎn)的基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)，進(jìn)一步采用二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，Thr399Ile位點(diǎn)TT 基因型是兒童哮喘易感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CC基因型為哮喘的保護(hù)基因。本研究納入樣本量較小，且并未進(jìn)行多因素的分層分析，地域不同，種族差異，哮喘的表型不同可能會導(dǎo)致在不同的地區(qū)出現(xiàn)不同的結(jié)果。支氣管哮喘的機(jī)制是復(fù)雜的，在導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)生的過程中，還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究，以便從基因多態(tài)性的的角度來尋求新的視野，對支氣管哮喘的發(fā)生機(jī)制和免疫治療方面找到可利用的價(jià)值。

綜上所述，哮喘患兒 TLR4 基因Thr399Ile 位點(diǎn)的基因型主要以TT 為主，T 等位基因分布頻率高。哮喘患兒TLR4 基因Thr399Ile 位點(diǎn)基因多態(tài)性與兒童哮喘的發(fā)病相關(guān)。這提示TLR4與哮喘有密切關(guān)系，為闡明哮喘發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了依據(jù)和思路，為哮喘的診療提供了一定理論基礎(chǔ)。