泛耐藥銅綠假單胞菌菌株廣譜噬菌體裂解酶的獲取及抗菌活性觀察

王猛，蔡大敏 ，王景雨，王策，邵煜涵，穆紅

1 南開大學(xué)附屬天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192；2 杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院；3 天津醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌。PA是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界和人體皮膚、黏膜、呼吸道、胃腸道等部位中［1］。免疫力低下或不當(dāng)介入性操作后PA可引起皮膚、呼吸道、泌尿道等系統(tǒng)感染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致菌血癥、心內(nèi)膜炎等［2］，是院內(nèi)感染的主要病原菌之一［3］。抗生素的廣泛使用導(dǎo)致PA耐藥株的出現(xiàn)，目前PA耐藥率位居革蘭氏陰性桿菌首位。PA已成為醫(yī)院內(nèi)獲得性感染中最常見的多重耐藥條件致病菌［4］。因此，要研究新抗菌方法來預(yù)防和治療泛耐藥PA導(dǎo)致的感染，是目前的研究熱點(diǎn)。噬菌體（Bacteriophage）又被稱為細(xì)菌病毒，是一類以微生物（包括細(xì)菌、螺旋菌、放線菌或真菌等）為宿主的病毒，通過特異性的侵入細(xì)菌，利用菌體內(nèi)部的功能結(jié)構(gòu)，合成自身成份，完成復(fù)制繁殖［5］。噬菌體可分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體［6］。其中裂解性噬菌體在感染宿主菌后可立即啟動(dòng)自身基因表達(dá)，通過基因表達(dá)產(chǎn)物降解宿主DNA，終止宿主基因表達(dá)，奪取宿主DNA復(fù)制亞細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)，大量合成噬菌體核酸并表達(dá)噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，在宿主菌菌體內(nèi)組裝產(chǎn)生下一代噬菌體，當(dāng)宿主菌內(nèi)噬菌體積累到一定水平，可促進(jìn)噬菌體穿孔素表達(dá)，穿孔素導(dǎo)致宿主菌內(nèi)膜形成孔洞，同時(shí)噬菌體釋放的裂解酶（endolysin）可分解細(xì)菌細(xì)胞壁，最終導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡［7］。裂解性噬菌體能夠特異性地裂解細(xì)菌，對(duì)正常菌群和人體細(xì)胞不構(gòu)成影響，且作用機(jī)制抗生素不同［8］。但使用噬菌體治療細(xì)菌感染可能存在一些不足，如噬菌體裂解細(xì)菌導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)、某些噬菌體攜帶的毒素基因引起機(jī)體毒素反應(yīng)、噬菌體自由增殖及噬菌體應(yīng)用劑量的把握等問題［9］。噬菌體還存在抗菌譜，對(duì)同種細(xì)菌不同菌株的抗菌效果也存在一定不同［10］。對(duì)噬菌體裂解酶進(jìn)行修飾，可能解決噬菌體毒素反應(yīng)、劑量控制、抗原性等不足，為細(xì)菌感染的治療提供了新思路，可能成為治療細(xì)菌感染的新方法。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于噬菌體裂解酶用于拮抗細(xì)菌的研究報(bào)道并不多見，有關(guān)泛耐藥PA菌株噬菌體裂解酶的相關(guān)研究報(bào)道更少見。2021年1月-2022年10月，我們篩選泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列，進(jìn)一步驗(yàn)證泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂裂解酶的抗菌活性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀靶版、CHCA基質(zhì)液及ATS-335藥敏卡均購自法國(guó)梅里埃公司），CaCl（2天津市北辰方正試劑廠）、LB培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）、一次性濾器（美國(guó)默克密理博公司）、溴化乙錠（美國(guó)賽默飛公司）、PCR反應(yīng)試劑盒及DL15000 DNA marker（大連寶生物工程公司），瓊脂糖凝膠、DNA凝膠純化試劑盒、基因組提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司），限制性內(nèi)切酶、T4連接酶及卡那霉素（大連寶生物工程公司），Ni2+親和層析柱（美國(guó)GE公司）、PCR擴(kuò)增引物、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序金唯智生物科技有限公司完成、電鏡圖片由杭州醫(yī)學(xué)院合作單位完成。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀、自動(dòng)比濁儀及VITIK2 compact全自動(dòng)微生物分析儀均購自法國(guó)梅里埃公司，CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon公司）、-80 ℃低溫冰箱（青島海爾公司）、電泳儀（北京六一電泳儀廠）、自動(dòng)凝膠成像儀及電轉(zhuǎn)化儀（美國(guó)伯樂公司）、PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體的篩選 ①泛耐藥PA菌株的篩選（細(xì)菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)）：收集2016-2020年我院臨床分離保存的PA菌株237株，均經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀鑒定后保留。采用藥敏試驗(yàn)，用比濁儀配制0.5麥?zhǔn)蠞舛萈A懸液，轉(zhuǎn)移至ATS-335藥敏測(cè)試卡，啟動(dòng)VITIK2 compact全自動(dòng)微生物分析儀觀察PA菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類常用抗生素的耐藥性。最終篩選得到84株泛耐藥PA菌株。②泛耐藥PA菌株噬菌體的篩選（噬菌斑測(cè)定法）：采集天津市第一中心醫(yī)院污水處理站尚未消毒的污水樣本（噬菌體作為細(xì)菌病毒在污水中普遍存在［11］），0.1 g/L濃度加入CaCl2，10 000 g/min離心10 min除去固體雜質(zhì)，收集上清，重復(fù)3次。取300 mL污水濾液，加入10株0.3 mL的泛耐藥PA菌株懸液，混勻后室溫靜置60 min，搖床180 r/min，37 ℃過夜培養(yǎng)。將混懸液加入47 ℃融化的0.7%瓊脂LB培養(yǎng)基2 mL，混勻后于固體LB平板鋪平，37 ℃過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后觀察各培養(yǎng)基噬菌斑出現(xiàn)情況。有噬斑的培養(yǎng)基為存在泛耐藥PA菌株噬菌體的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)增殖、純化后獲得泛耐藥PA噬菌體9株，噬菌體大小均一，噬菌斑明顯。③取9支EP管分別加入1麥?zhǔn)蠞舛确耗退嶱A菌株懸液0.3 mL+0.3 mL的PA噬菌體原液，混勻后培養(yǎng)24 h后觀察噬菌斑出現(xiàn)情況。選取90%以上泛耐藥PA菌株均出現(xiàn)噬菌斑的噬菌體為泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體。

1.4 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因的獲取、序列確認(rèn)

1.4.1 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因的獲取與測(cè)序 采用Proteinase K裂解法獲取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因，取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體，加入終濃度為 5 μg/mL 的 DNaseI及 1 μg/mL 的RNaseA，37 ℃溫育 1 h，降解宿主菌的 DNA和RNA。加入固體PEG8000至10%（w/v）冰浴1 h。4 ℃ 12 000 g/min 離心10 min后棄上清。采用基因組提取試劑盒提取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因序列，由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列的確定 利用數(shù)據(jù)庫ORF finder和BLAST預(yù)測(cè)泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因開放閱讀框，使用RNAmmer和tRNAsan-SE軟件確定泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體的rRNA、tRN的基因序列，用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTN和BLASTP在線進(jìn)行對(duì)比分析后，篩選得到泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶。

1.5 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶的獲取 、抗菌活性觀察

1.5.1 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶獲取 采用Primer premier5.0軟件根據(jù)泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。lysEPA19上游引物為CCGGAATTCATGACTGCYGATCAGG（529 bp），下 游 引 物 為 ATCAAGCTTTCATTGGTCACCACCC（529 bp）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，終延伸 5 min，共40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用限制性內(nèi)切酶酶切目的片段LysEPA19和質(zhì)粒pET28a，T4連接酶連接目的片段和質(zhì)粒，構(gòu)建pET28a-LysEPA19重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以確定含有泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，用含終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃ 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后離心收集菌體，冰浴超聲波破碎，4 ℃低溫離心后取上清，用Ni-NTA親和層析純化，收集洗脫液，用SDS-PAGE電泳結(jié)果比對(duì)獲得蛋白分子質(zhì)量與泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶。

1.5.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶的抗菌活性觀察 取復(fù)蘇傳代的泛耐藥PA菌株菌液，將其均勻涂抹至2個(gè)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別滴加5、10 μL的泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)基上噬菌斑情況，如出現(xiàn)噬菌斑且越大說明抗菌效果越好。

2 結(jié)果

篩選得到泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19。提取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19基因組。

對(duì)EPA19進(jìn)行全基因組測(cè)序后預(yù)測(cè)開放閱讀框90個(gè)，最終比對(duì)發(fā)現(xiàn)噬菌體EPA19裂解酶所在位置（ORF54），并將其命名為L(zhǎng)ys EPA19。成功純化得到Lys EPA19蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示Lys EPA19蛋白分子質(zhì)量（27 kd）與目的蛋白相符。

培養(yǎng)泛24 h時(shí)加入5、10 μL的Lys EPA19培養(yǎng)基中均可見噬菌斑，且滴加10 μL的Lys EPA19培養(yǎng)基的噬菌斑大（見圖1），5 μL LysEPA19噬菌斑為11～13 mm，10 μL的 LysEPA19噬菌斑為23～27mm。

圖4 泛耐藥PA菌株加入Lys EPA19培養(yǎng)后噬菌斑生長(zhǎng)情況

3 討論

PA具有易定植、易變異及復(fù)雜的耐藥機(jī)制，重癥患者感染PA后預(yù)后較差［12］。 鑒于PA感染的普遍性和嚴(yán)重程度，美國(guó)感染病學(xué)會(huì)已將其列為臨床六大最危險(xiǎn)致病菌之一［13］。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)［4］顯示，泛耐藥PA菌株逐年增多。本研究中泛耐藥PA菌株的檢出率為35.4%，與以往研究報(bào)道類似。因此噬菌體及其裂解酶的治療PA感染是目前的研究熱點(diǎn)。

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，其侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生酶破壞細(xì)胞壁從而裂解細(xì)菌。溶原性噬菌體和裂解性噬菌體［10］。前者是感染細(xì)菌后不增殖、不裂解細(xì)菌，而是將其核酸整合到細(xì)菌核酸上一起復(fù)制傳代；后者是在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體并控制編碼裂解酶最終使細(xì)菌裂解，也稱毒性噬菌體。它產(chǎn)生的裂解酶主要作用于水解細(xì)菌細(xì)胞壁上的聚糖骨架［14-15］。多數(shù)噬菌體裂解酶都具有“雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)”的特點(diǎn)，即N-端結(jié)構(gòu)域具有催化活性，可以特異的切斷肽聚糖（peptidoglycan，PG）的化學(xué)鍵，也稱催化域 （catalytic domain）［16］。催化域中含有5種主要類型的酶活性：N-乙酰胞壁酶、轉(zhuǎn)糖苷酶、內(nèi)-b-N-乙酰氨基葡糖苷酶、內(nèi)肽酶或者N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。催化結(jié)構(gòu)域主要作用于細(xì)胞壁上的聚糖骨架或者多肽鏈之間的酰胺鍵［17］，還有少部分作用于肽聚糖比如分支桿菌噬菌體裂解酶［6］。所以作為抗菌手段之一的噬菌體裂解酶的研究對(duì)臨床有重要價(jià)值而且還需要繼續(xù)深入的探討。

裂解酶作為極具潛力的抗生素替代物，它的高效、寬譜的裂解活性以及對(duì)理化因素的穩(wěn)定性是實(shí)際應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)［8］。本研究以分離的耐藥PA廣譜噬菌體為材料，提取其基因組進(jìn)行測(cè)序和分析。將噬菌體編碼的裂解酶通過克隆表達(dá)并誘導(dǎo)純化得到重組蛋白，本研究還測(cè)定了裂解酶lysEPA19的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌有較好的裂解效果，為其未來應(yīng)用提供了許多可能性，也同時(shí)為后續(xù)尋找新型噬菌體裂解酶以及探索裂解酶的機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

目前針對(duì)感染細(xì)菌注射裂解酶已有一些方面的研究，有幾種類型的注射已被證明其在動(dòng)物模型中有效［18-21］。 ENTENZA等關(guān)注靜脈內(nèi)注射裂解酶的研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了一定效果。ADEL ABOUHMAD等［20］將T4裂解酶與纖維素融合模塊用于將裂解酶固定在纖維素紗布材料上，該傷口敷料具有抗革蘭陽性菌的活性，同時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)了敷料抗血管生成作用和保質(zhì)期。SCHUCH等［21］測(cè)試的金黃色葡萄球菌菌株（包括MRSA分離株） 噬菌體裂解酶抗菌活性，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂解酶能明顯提高患葡萄球菌性菌血癥小鼠的存活率。BLAS BLAZQUEZ則利用鏈球菌噬菌體裂解酶有效控制肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)［22］。除了針對(duì)革蘭氏陽性菌以外， LOOD等［23-24］學(xué)者對(duì)革蘭氏陰性菌裂解酶也取得了一些進(jìn)展，尤其是在耐藥鮑曼不動(dòng)菌裂解酶的研究進(jìn)展明顯。我國(guó)學(xué)者［25-26］均成功篩選出PA噬菌體裂解酶，并進(jìn)一步驗(yàn)證其有效性。

本研究基于國(guó)內(nèi)外對(duì)噬菌體裂解酶的研究，展開針對(duì)泛耐藥PA菌株噬菌體裂解酶抗菌的嘗試，成功篩選并表達(dá)出泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶lysEPA19，并完成其活性驗(yàn)證，達(dá)到預(yù)期效果。但本實(shí)驗(yàn)中也存在不足，第一，未做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶蛋白lysEPA19活性，第二，未對(duì)lysEPA19蛋白進(jìn)行加工修飾，探討其成為治療藥物的可能性。天然裂解酶都為窄譜裂解酶，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中我們已經(jīng)篩選出相對(duì)廣譜的裂解酶，但若繼續(xù)擴(kuò)寬抗菌譜則需在蛋白層面對(duì)裂解酶進(jìn)行修飾，以擴(kuò)寬裂菌譜和降低不良反應(yīng)，并且裂解酶lysEPA19與抗生素聯(lián)用的協(xié)同抗菌性以及裂解酶的長(zhǎng)時(shí)間殺菌活性也亟待進(jìn)一步研究，以期達(dá)到臨床使用的要求，為抗耐藥銅綠假單胞菌治療提供新的手段。

綜上所述，成功篩選出泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19及裂解酶Lys EPA19。Lys EPA19可有效抑制泛耐藥PA菌株的生長(zhǎng)。