黃水中乳酸檢測(cè)方法的研究開發(fā)

李隆淼，李楊華，廖勤儉，胡嬌，安明哲，羅珠

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

乳酸是白酒中最重要的有機(jī)酸之一，其含量的高低直接影響酒的口感和后味[1]。白酒釀造過程中微生物的活動(dòng)代謝產(chǎn)生大量乳酸，白酒蒸餾過程糟醅中的乳酸通過拖帶等作用進(jìn)入到白酒中，因此酒醅和白酒中乳酸含量均較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，原酒中乳酸含量較高，為366～1581 mg/L[2]，作為白酒四大酸（乳酸、乙酸、丁酸和己酸）之一，分析其含量是檢測(cè)工作中重要的環(huán)節(jié)之一。白酒和糟醅中乳酸的檢測(cè)方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、比色法、綜合法、離子色譜法等[3-6]。

黃水作為白酒固態(tài)發(fā)酵過程中重要的副產(chǎn)物，乳酸含量極高，但黃水中乳酸的檢測(cè)報(bào)道不多見，僅有的報(bào)道均是對(duì)黃水進(jìn)行簡單稀釋過濾的前處理后用液相色譜法測(cè)定。梅婕[7]對(duì)黃水經(jīng)離心和稀釋的前處理后，以甲醇和磷酸二氫銨的水溶液為流動(dòng)相，通過安捷倫Poroshell 120 EC C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）進(jìn)行分離，樣品的回收率較高、精密度良好；馬金同[8]將黃水樣品經(jīng)稀釋、過濾，直接進(jìn)樣，以0.02 mol/L 磷酸二氫鉀作流動(dòng)相，采用Acquity HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）分離，建立了黃水中乳酸的分析檢測(cè)方法，精密度和回收率均滿足方法學(xué)要求。

本研究改進(jìn)了前人對(duì)黃水的前處理方法，采用甲醇震蕩除雜后進(jìn)樣的方式，既保持了乳酸的純度也避免了黃水中大量大分子蛋白、纖維素等對(duì)色譜柱的污染。方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法精密度良好、回收率較高，同時(shí)延長了色譜柱壽命，可用于黃水中乳酸的批量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：四川某酒企黃水樣品。

試劑：甲醇（LC/MS級(jí)，純度≥99.5 %，Sigma）；乳酸（色譜純，純度≥89.8 %，ACROS）；磷酸（分析純，純度≥85%，西隴化工股份有限公司）。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜儀（Agilent 1100 series），美國安捷倫科技公司，配二極管陣列檢測(cè)器；超純水發(fā)生器（Milli-Q Integral 3），美國Millipore公司；萬分之一分析天平（AE200），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；移液槍（Eppendorf）；0.2 μm有機(jī)濾膜（希波氏），太倉道邦色譜科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

磷酸溶液的制備：準(zhǔn)確量取1.2 mL 磷酸至1000 mL 容量瓶中，超純水溶解并定容至1000 mL，超聲振蕩均勻備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取1 g 乳酸至100 mL容量瓶中，超純水溶解并定容至100 mL，該溶液為10000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)樣品母液，后將其分別稀釋至1000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、50 mg/L、25 mg/L，測(cè)定后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黃水樣品前處理：黃水中含有大量的大分子物質(zhì)如還原糖、淀粉、蛋白質(zhì)等,以及部分固形物、微生物等，這類雜質(zhì)若不除去會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不可逆的影響，因此進(jìn)樣前需進(jìn)行除雜。用9 倍體積甲醇沉淀黃水中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，振蕩5 min，14000 r/min 離心5 min 取上清液，上清液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后0.2 μm濾膜過濾，待上機(jī)分析。

色譜條件：Venusil ASB C18色譜柱（4.6×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：0.12 % H3PO4溶液，0.2 μm 濾膜過濾，流動(dòng)相流速1 mL/min；檢測(cè)波長214 nm，柱溫箱30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸色譜定性分析

取適量乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品母液用0.12 %磷酸溶液稀釋至1000 mg/L，按照1.2 中的前處理方法處理黃水樣品，檢測(cè)對(duì)比兩樣品以進(jìn)行乳酸峰的定性分析。標(biāo)準(zhǔn)樣品和黃水樣品色譜檢測(cè)分析結(jié)果見圖1和圖2。從圖1 可以看出，乳酸標(biāo)準(zhǔn)品及黃水樣品色譜圖中乳酸保留時(shí)間一致，分別為4.979 min 和4.976 min，黃水樣品乳酸峰與乙酸峰分離度較好，判定該方法滿足測(cè)量需求。

圖1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖

圖2 黃水樣品液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以2.2 中5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度作定量分析，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）X 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，檢測(cè)結(jié)果見表1，線性關(guān)系見圖3。

從表1 和圖3 得出以下結(jié)論：在25～1000 mg/L范圍內(nèi)，乳酸濃度與峰面積的比值呈線性關(guān)系，回歸方程式為Y=0.2657X-0.0613,相關(guān)系數(shù)R2=1。

圖3 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一黃水樣品和1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，在重復(fù)性條件下獲得平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值），評(píng)價(jià)其方法的重現(xiàn)性。驗(yàn)證結(jié)果如表2 所示：在重復(fù)性條件下平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品和黃水樣品的RSD 值分別為0.04 %、0.74 %、0.03%和0.52%，精密度符合方法學(xué)的要求。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)

2.4 加標(biāo)回收率

取白酒黃水樣品，一份經(jīng)1.2 中前處理方法處理后，作為空白樣品及本底值，另外3 份分別加入10000 mg/L、15000 mg/L、20000 mg/L 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再經(jīng)1.2 中前處理方法處理后，進(jìn)行回收率測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果見表3。

從表3 可以看出，在黃水樣品中加入已知濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的回收率較好，低、中、高濃度的回收率分別為101.14 %、89.47 %和91.38 %，滿足回收率的要求。

表3 黃水中乳酸回收率

3 結(jié)論

本研究建立了用高效液相色譜快速檢測(cè)黃水中乳酸含量的分析方法。黃水經(jīng)過甲醇除雜前處理稀釋過濾并直接進(jìn)樣，等度洗脫分析，乳酸出峰時(shí)間保持在5 min 左右；在25～1000 mg/L 范圍內(nèi)，有較好的線性關(guān)系，R2為1，加標(biāo)回收率為89.47%～101.14%，檢出限為1.15 mg/L，定量限為3.83 mg/L。該方法前處理用甲醇沉淀黃水中的蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)可以保持樣品的純度，同時(shí)保證色譜柱不被污染，延長其壽命，適用于黃水中乳酸的分析檢測(cè)。