分光光度法測定配制酒中氰化物的不確定度評定

葉春常，陳桂云，黎穎欣，胡雯艷，陳韻

(廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400)

酒中氰化物主要由原料(如木薯、代用品、豆類及其他果核或混入一些野生植物)中的氰甙類配糖體在發(fā)酵過程中水解產(chǎn)生[1]。氰化物屬于有毒物質(zhì)，極少量的氰化物就會導(dǎo)致人或者動物中毒甚至死亡。因此，氰化物是酒類一項(xiàng)非常重要的安全指標(biāo)[2]。

目前用于測定酒中氰化物的方法主要有分光光度法[3-4]、原子吸收法[5-6]、硝酸銀滴定法[7]、氣相色譜法[8-9]、離子色譜-脈沖安培檢測法[10]等。國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測定》[11]中測定氰化物的方法就是分光光度法和氣相色譜法。在上述的檢測方法中，分光光度法是最常見的方法。

本研究參考CNAS—GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[12]，通過分析分光光度法測定配制酒中氰化物的過程中影響檢測結(jié)果的不確定度因素，評估該檢測的不確定度，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)樣品：市售配制酒。

試劑及耗材：酚酞、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、冰乙酸、無水乙醇（均為AR），廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉（AR），廣東光華科技股份有限公司；異煙酸（AR），阿拉?。痪剖?、氯胺T（均為AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吡唑啉酮(AR)，上海晶純化學(xué)試劑廠；氰化物標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL），中國計量科學(xué)研究院。

儀器設(shè)備：U-3010 紫外可見分光光度計，日本日立公司；WD20A12E 數(shù)控水浴鍋，美國Poly-Science 公司；C-MAG HP 10（S25）控溫加熱器，艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分析步驟

參考GB 5009.36—2016 中5.2 配制酒的方法進(jìn)行處理。

1.2.2 計算公式

配制酒中氰化物（以HCN計，按100 %酒精度換算）的含量按下式計算：

式中：X為樣品中氰化物含量，mg/L；X0為平均實(shí)測含量（以CN-計），μg；m 為試樣體積，mL；V 為樣品稀釋倍數(shù)；P 為酒精度，%vol；1000 為換算系數(shù)；MHCN為氰化氫（HCN）的摩爾質(zhì)量，g/mol；MCN為氰離子（CN-）的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.2.3 測量不確定的來源分析

根據(jù)檢驗(yàn)過程及計算公式，氰化物含量的不確定度來源及其分量如表1所示。

試樣體積、實(shí)測含量和樣品制備的重復(fù)性合并為整體樣品測定重復(fù)性考慮。樣品配制酒為液體，取樣時充分搖勻，可認(rèn)為試樣是均勻的，具有代表性，所以樣品均勻性對不確定度的影響可忽略不計。相應(yīng)的不確定度來源及其分量修正如表2所示。

表2 經(jīng)過修正后的不確定度來源及其分量

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

上式可轉(zhuǎn)換為：

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣體積引入的不確定度urel(1)評定

渾濁或有色樣品，取25.0 mL 試樣進(jìn)行蒸餾。不確定度來源為移液管的校準(zhǔn)偏差和溫度效應(yīng)，校準(zhǔn)偏差的計算可參照校準(zhǔn)證書提供的擴(kuò)展不確定度計算，溫度效應(yīng)根據(jù)公式（4）計算：

其中，2.1×10-4為水的膨脹系數(shù)，單位為/℃；t0為量器校準(zhǔn)時的室溫，20 ℃；t1為配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時的室溫，25 ℃。

移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式（5）計算：

其中，U 為移液管校準(zhǔn)證書提供的擴(kuò)展不確定度U=0.015 mL，k 為證書提供的包含因子k=2，V 為移液管的體積。

2.2 樣品實(shí)測含量引入的不確定度urel(2)評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(2.1)

氰化物含量是通過最小二乘法擬合的曲線計算所得，不確定度與樣品測定的次數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)系列測定次數(shù)有關(guān)，同時和樣品平均值與標(biāo)準(zhǔn)系列平均值的差值有關(guān)。

檢測過程中，配制6個濃度點(diǎn)（0.00 μg、0.40 μg、0.80 μg、1.20 μg、1.60 μg、2.00 μg）的標(biāo)準(zhǔn)系列，每濃度點(diǎn)平行測定3次，制備10 個平行樣，得到10 個樣品測定值，用最小二乘法計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=bx+a，根據(jù)擬合的回歸曲線求得被測樣品的氰化物含量。測定結(jié)果見表3、表4。

根據(jù)擬合得到的曲線，按照表3、表4、公式（6）、公式（7）計算urel(2.1)，相關(guān)數(shù)據(jù)填入表5中。

表3 回歸曲線的吸光度計算

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(2.1)計算

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(2.2)評定

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度urel(2.2.1)和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度urel(2.2.2)，則：

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度urel(2.2.1)評定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，氰化物標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)值為50.0 μg/mL，相對擴(kuò)展不確定度為1 %（k=2），轉(zhuǎn)換成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度urel(2.2.2)評定

標(biāo)液稀釋：用單標(biāo)吸管吸取2.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL 容量瓶中，用2 g/L 氫氧化鈉溶液定容，為標(biāo)準(zhǔn)使用液。2 mL 刻度吸管分別吸取0 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL 具塞比色管中。標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中的體積受玻璃量器的容量偏允差和實(shí)驗(yàn)室溫度的波動影響，配制過程中使用單標(biāo)吸管、容量瓶、刻度吸管、具塞比色管，將各類量器相應(yīng)的數(shù)據(jù)填入表6中，參考公式（4）、（5）分別計算出各量器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

表6 量器引入的不確定度

按B 類評定計算相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度urel(2.2.2)：

2.2.3 儀器示值引入的不確定度urel(2.2.3)評定

檢測過程使用的分光光度計的示值分辨率會對吸光度值讀數(shù)產(chǎn)生影響，從而引入了不確定度，儀器計量證書提供的擴(kuò)展不確定度U=0.3 %（k=2），由樣品實(shí)測含量平均值X0代入回歸方程y=bx+a 中得到平均吸光度值A(chǔ)=0.324，儀器示值引入的不確定度計算可按公式（12）進(jìn)行。

樣品實(shí)測含量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(2)為：

2.3 樣品制備引入的不確定度urel(3)評定

試樣進(jìn)行蒸餾后定容至50 mL比色管，用2 mL單標(biāo)吸管吸取2.0 mL 餾出液測定。此時不確定度來源為餾出液移取移液管urel(3.1)和定容比色管體積不確定度urel(3.2)。由公式（14）、表6得：

2.4 樣品酒精度引入的不確定度評定urel(4)評定

樣品氰化物含量平均值X0（以CNˉ計）需經(jīng)酒精度換算為試樣中氰化物（以HCN計，按100%vol酒精度換算）的含量，酒精度的結(jié)果引入了不確定度。經(jīng)測定，樣品酒精度含量P=41.2%vol，擴(kuò)展不確定度U=0.3 %vol（k=2），酒精度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 樣品重復(fù)性測定引入的不確定度urel(5)評定

制備10 個平行樣，每個樣品測定2 次。測定結(jié)果如表4。

單次測量的不確定度為：

測量結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 氰化氫摩爾質(zhì)量引入的不確定度urel(6)評定

從現(xiàn)行有效的IUPAC 原子量表中查得HCN 和CN-各元素的原子量和不確定度：

表7 HCN中各元素的原子量和不確定度

對于每一個元素來說，標(biāo)準(zhǔn)不確定度是將IUPAC 所列不確定度做為矩形分布的邊界計算得到的。因此相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于查得數(shù)值除以。

HCN的摩爾質(zhì)量為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.7 氰離子摩爾質(zhì)量引入的不確定度urel(7)評定

表8 各分量的不確定度匯總

CN-的摩爾質(zhì)量為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定：

2.8 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度計算

2.8.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述數(shù)據(jù)urel(1)—urel(7)代入公式（2）得到被測樣品含量的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc,rel(X)，再按公式（22）轉(zhuǎn)換成合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(X)：

2.8.2 擴(kuò)展不確定度

測量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率p=95%，包含因子k＝2，則擴(kuò)展不確定度U為：

2.9 結(jié)果報告

樣品中氰化物的含量為(2.5±0.1)mg/L，k=2。

3 結(jié)論

本研究采用分光光度法對配制酒中的氰化物含量進(jìn)行檢測，分析評估檢測過程的各個不確定度來源及其大小。結(jié)果表明，實(shí)測含量、測定重復(fù)性引入的不確定度最大，樣品制備和酒精度引入的不確定度次之，試樣體積、氰化物和氰離子的分子量引入的不確定度最小。因此，在檢測過程中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制要準(zhǔn)確，儀器應(yīng)該嚴(yán)格按要求及時校準(zhǔn)并保持良好的狀態(tài)，規(guī)范檢測過程中的操作，才能更好提高檢測的準(zhǔn)確度。