雪蓮培養(yǎng)物對酒精性肝損傷及酒精代謝的影響研究

曹坦，李勝男，龍則河

（大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，遼寧大連 116001）

菊科植物天山雪蓮Saussurea involucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.為藥食同源植物，藥用記載始于藏醫(yī)藥著作《月王藥珍》，具有溫腎助陽，祛風(fēng)去濕，痛經(jīng)活血等功效，系維吾爾族習(xí)用藥材[1]。在新疆等地區(qū)，雪蓮泡酒食用十分常見。天山雪蓮生長分布范圍稀缺，生長環(huán)境特異，存在過度采挖、栽培困難等問題，野生資源瀕臨滅絕。1996年天山雪蓮被列為國家二級瀕危植物；2000 年國務(wù)院13 號文件明令禁止采挖野生雪蓮。通過植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲取天山雪蓮細(xì)胞，解決了野生天山雪蓮資源緊缺的問題。2010年，原衛(wèi)生部批準(zhǔn)雪蓮培養(yǎng)物為新資源食品。雪蓮培養(yǎng)物具有苯丙素類、黃酮類、木脂素類和甾體類等化學(xué)成分[2]，具有抗炎[3]、抗缺氧[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、降血脂[6]等藥理作用。

酒精性肝損傷(alcoholic live disease,ALD)是指長期或大量飲用含有乙醇的飲料而引起的肝臟疾病[7]。在我國，酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升，其危害僅次于病毒性肝炎。已有研究表明，天山雪蓮乙醇提取物對缺氧小鼠肝臟線粒體具有保護(hù)作用[8]；對力竭性游泳過程中造成的小鼠肝、腎損傷有一定的保護(hù)作用[9]。未見雪蓮培養(yǎng)物對酒精性肝損傷保護(hù)等的相關(guān)研究報道。

本研究探究雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠模型的肝功能的作用，分析雪蓮酒和基酒灌胃后，小鼠體內(nèi)酒精代謝情況，分析基酒和雪蓮酒灌胃后，小鼠肝的相關(guān)指標(biāo)變化，探討雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷、雪蓮酒對酒精代謝速度及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗一：雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠的影響

1.1.1 小鼠分組處理及樣品制備

昆明小鼠，雌雄各半（4～6 周）。將昆明小鼠隨機分為空白對照A 組、模型組、雪蓮培養(yǎng)物高（28.57 mg/kg）、中（14.28 mg/kg）、低（7.14 mg/kg）劑量組及陽性藥組（水飛薊賓10 mg/kg）。每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對照A 組和模型組給予蒸餾水（10 mL/kg）。每周稱重兩次，按體重調(diào)整受試樣品劑量，給藥時長為30 d。給予受試樣品結(jié)束時將模型組及各樣品組一次灌胃給予50 %乙醇12 mL/kg·BW，空白對照組A 給蒸餾水，禁食16 h，乙醚麻醉后，正中切口進(jìn)腹，于下腔靜脈穿刺，抽取血液標(biāo)本，分離肝組織，用于各項指標(biāo)的檢測及病理組織學(xué)檢查。

1.1.2 肝損傷相關(guān)指標(biāo)測定

取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2 M 磷酸鹽緩沖液，以20000 r/min 勻漿10 s，間歇30 s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成5 %組織勻漿(W/V)，3000 r/min 離心5～10 min，取上清液進(jìn)行丙二醛(MDA)測定。取肝臟0.5 g 加生理鹽水5 mL 充分研磨成細(xì)漿(10 %肝勻漿)，混勻后取漿液0.5 mL 加4 %磺基水楊酸0.5 mL 混勻，室溫下3000 r/min 離心10 min，取上清液即為樣品，進(jìn)行還原型谷胱甘肽(GSH)測定。取肝臟0.1 g 加無水乙醇0.9 mL 冰水浴條件下機械勻漿(2500 r/min)，離心10 min，取上清液待測。參考試劑盒說明進(jìn)行甘油三酯(TG)測定。

1.1.3 肝臟病理組織學(xué)變化及診斷標(biāo)準(zhǔn)

從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，油紅O 染色。從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化，用40 倍物鏡連續(xù)觀察整個組織切片。主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在，稀少，記0 分；含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/4，記1 分；含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/2，記2 分；含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/4，記3 分；肝組織幾乎被脂滴代替，記4分。

1.2 實驗二：小鼠體內(nèi)酒精代謝檢測

1.2.1 小鼠分組處理及樣品制備

昆明小鼠，雄性，體重30～35 g。小鼠禁食不禁水12 h后，按下述劑量灌胃，飼養(yǎng)期間禁食不禁水。將小鼠隨機分為空白對照B 組（蒸餾水10 mL/kg）、雪蓮酒高（12 mL/kg）、中（8 mL/kg）、低（4 mL/kg）劑量A 組及基酒A 組（用量同上）。小鼠稱重并記錄。取健康小鼠，分別在灌胃30 min、1 h、6 h、12 h后，小鼠眼球取血，室溫放置30 min，常溫置離心機中3000 r/min 離心10 min。精密吸取上層血清100 μL 加入等量的二甲基亞砜，置SK-1 快速混勻器中混勻后，以15000 r/min 離心10 min。取上清液0.22 μm 有機系微孔濾膜濾過后測定，以保留時間定性，以峰面積定量。

表1 雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠肝臟中MDA、GSH、TG的影響(x±s)

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱取無水乙醇2800 mg 于100 mL 量瓶，用50%二甲基亞砜水溶液稀釋至刻度，作為乙醇母液，用經(jīng)校正的微量移液器分別取5 mL、2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.2 mL、0.1 mL 乙醇母液置于20 mL量瓶，用50%二甲基亞砜水溶液稀釋配制成不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(7 mg/mL、3.5 mg/mL、1.4 mg/mL、0.7 mg/mL、0.28 mg/mL、0.14 mg/mL)。以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，乙醇峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent HP-5 5 % phenyl methyl siloxane 30 m×320 μm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度為240 ℃；FID 檢測器溫度為270 ℃；色譜升溫程序：70 ℃(保留1 min)，5 ℃/ min 升至90 ℃(保留1 min)，40 ℃/min 升至270 ℃直到分析完成；載氣：氮氣流速為1 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為300 mL/min，分流比為20∶1。

1.3 長期飲酒后小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)測定

昆明小鼠，雄性，體重30～35 g。將小鼠隨機分為空白對照C 組（蒸餾水10 mL/kg）、雪蓮酒B 組（中劑量8 mL/kg）、基酒組B（用量同上）。按上述劑量連續(xù)灌胃兩個月，每天灌胃一次。相關(guān)指標(biāo)含量測定按照“1.1 雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠的影響”方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠的影響

與空白對照A 組比較，模型組小鼠在制備急性酒精肝損傷模型后，肝臟中的MDA及TG含量顯著升高，肝臟中的GSH 含量顯著降低，表示肝損傷建模成功，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組小鼠相比，雪蓮培養(yǎng)物低、中劑量組小鼠肝臟中MDA 顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；與模型組小鼠比較，雪蓮培養(yǎng)物低、中、高劑量組小鼠肝臟GSH 顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組小鼠相比，雪蓮培養(yǎng)物低、中劑量組小鼠肝臟中TG顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察，空白對照A 組的小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完好，脂滴少；模型組小鼠可見明顯的脂肪變性，出現(xiàn)大量脂肪空泡，提示酒精肝損傷建模成功。與模型組相比，雪蓮培養(yǎng)物各劑量組出現(xiàn)不同程度的脂滴減少，肝組織結(jié)構(gòu)趨向正常，見圖1。

圖1 小鼠肝臟切片的病理組織學(xué)觀察（油紅O染色）

小鼠肝組織脂肪變性程度積分，與空白對照A組比較，模型組小鼠在制備急性酒精肝損傷模型后，肝臟變性程度顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；與模型組小鼠相比，雪蓮培養(yǎng)物低、中、高劑量組小鼠肝臟變性程度顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 小鼠體內(nèi)酒精代謝情況

實驗結(jié)果表明，基酒A 組與雪蓮酒A 組小鼠血清中乙醇濃度均與灌胃劑量成正比。經(jīng)不同時間采血測定血液乙醇含量，與基酒A 組比較，相應(yīng)劑量的雪蓮酒A 組小鼠血液中乙醇含量均降低，尤其在30 min、60 min，雪蓮酒A 組小鼠血液酒精含量明顯低于基酒A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。基酒A 組與雪蓮酒A 組小鼠血清中乙醇濃度均與灌胃劑量成正比。與基酒A 組小鼠比較，各個時間點相應(yīng)劑量的雪蓮酒A 組小鼠血液中乙醇含量均降低。以上結(jié)果說明，與基酒比較，雪蓮酒一定程度上促進(jìn)了小鼠血液的酒精代謝速度。

表2 雪蓮培養(yǎng)物對急性酒精肝損傷小鼠肝臟病理組織變化的影響

表3 雪蓮酒與基酒灌胃小鼠血清中乙醇含量的變化(x±s) (g/L)

2.3 長期飲酒對小鼠肝功能的影響

與空白對照C 組比較，經(jīng)雪蓮酒和基酒分別灌胃一個月后，小鼠肝臟MDA、TG 含量均有一定上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；基酒降低了GSH 含量，雪蓮酒無作用；雪蓮酒和基酒分別灌胃兩個月后，與空白對照C 組比較，基酒B 組MDA、TG 含量明顯升高，雪蓮酒無統(tǒng)計學(xué)差異；基酒和雪蓮酒不同程度降低了GSH 含量，雪蓮酒對GSH 降低程度更小。實驗結(jié)果說明與基酒相比，雪蓮酒對肝臟損傷程度較小。

3 結(jié)論

對小鼠進(jìn)行不同干預(yù)后，與模型組比較，雪蓮低、中劑量組急性酒精肝損傷小鼠肝臟MDA 含量顯著降低；經(jīng)GSH 活性檢測，與模型組比較，雪蓮低、中、高劑量組的小鼠肝臟GSH 含量顯著提高；以甘油三酯測定試劑盒測定急性酒精肝損傷小鼠肝勻漿中的TG 活性，與模型組比較，雪蓮低、中劑量組的小鼠肝臟TG含量顯著降低。經(jīng)油紅染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化，與模型組比較，雪蓮組低、中、高劑量組小鼠肝臟變性程度顯著降低。綜上說明，雪蓮培養(yǎng)物對小鼠酒精肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表4 雪蓮酒對小鼠肝臟中MDA、GSH、TG含量的影響(x±s)

對小鼠進(jìn)行不同酒劑灌胃，分別給予雪蓮酒或基酒半小時后，小鼠相繼出現(xiàn)不同程度的醉酒反應(yīng)，如精神不振和飲水量減少、活動少、走路不穩(wěn)、反抗力減弱、翻正反射消失、四肢皮溫高、心跳加快、易激惹、普遍出現(xiàn)用前爪撓嘴等現(xiàn)象。在醉酒后5～7 h，行為逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，雪蓮酒各劑量組的小鼠相對于基酒各劑量組的小鼠，醉酒行為較快恢復(fù)到正常狀態(tài)。實驗結(jié)果表明，基酒A 組與雪蓮酒A 組小鼠血清中乙醇濃度均與灌胃劑量成正比。與基酒A 組小鼠比較，各個時間點相應(yīng)劑量的雪蓮酒A 組小鼠血液中乙醇含量均降低。對小鼠進(jìn)行雪蓮酒和基酒灌胃后，與基酒B 組比較，雪蓮酒B 組小鼠醉酒行為較快恢復(fù)正常狀態(tài)。經(jīng)連續(xù)灌胃兩個月后，基酒B 組MDA、TG 含量明顯升高，基酒和雪蓮酒組GSH 含量均降低，基酒B 組的GSH降低程度更加明顯。以上結(jié)果說明，與基酒比較，雪蓮酒一定程度上促進(jìn)了小鼠血液的酒精代謝速度，同時雪蓮酒對肝臟損傷程度較小。

本研究分析結(jié)果表明，雪蓮培養(yǎng)物對小鼠急性酒精肝損傷具有一定的保護(hù)作用，雪蓮酒促進(jìn)了小鼠血液的酒精代謝速度，對肝臟損傷程度較小。研究對進(jìn)一步酒精性肝損傷保護(hù)研究具有重要意義，為雪蓮酒的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。