一種復(fù)合香型白酒糟醅微生物多樣性研究

薛江林，楊貴，張宿義，范宏筠，張煜亮，梅海，母娟，楊明永，杜鑫，王程

(1.瀘州國寶天釀集團(tuán)股份有限公司，四川瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000)

中國白酒由最初的濃香、醬香、清香3 種基本香型發(fā)展到如今的十三大香型[1]，逐漸轉(zhuǎn)向多種香型組合發(fā)展的方向。20 世紀(jì)90 年代末，各大酒企就提倡“濃香為主、多香并舉”的生產(chǎn)發(fā)展戰(zhàn)略[2]，以順應(yīng)社會快節(jié)奏、多社交、多頻次等的消費需求[3]。目前針對白酒釀造工藝融合的研究，在國外研究較少，國內(nèi)對于提高濃香型白酒出酒率及酒質(zhì)的研究一直是行業(yè)內(nèi)研究的重點，但在白酒釀造工藝融合的研究方面行業(yè)內(nèi)一直在探索前進(jìn)[4-6]。因此，本實驗在傳統(tǒng)瀘型酒釀酒工藝基礎(chǔ)上借鑒學(xué)習(xí)濃香型、醬香型、清香型白酒的釀造工藝，創(chuàng)新設(shè)計出一套特殊的白酒釀造工藝。通過分析不同工藝配料發(fā)酵過程的理化、風(fēng)味、微生物以及白酒品質(zhì)之間的關(guān)系不斷優(yōu)化調(diào)味酒釀造工藝；由多輪次試驗得到三組較優(yōu)的試驗方案，通過高通量測序技術(shù)對3 種試驗方案的堆積前、入窖、出窖的糟醅微生物多樣性、代謝途徑進(jìn)行分析研究；結(jié)合糟醅理化性質(zhì)，以及最終酒質(zhì)的感官嘗評結(jié)果，確定出最優(yōu)的工藝條件參數(shù)。本實驗為中國白酒調(diào)味酒種類的豐富提供了一定參考，也對不同香型白酒的生產(chǎn)技術(shù)做出了一定的歸納總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：糯紅高粱，四川聯(lián)眾供應(yīng)鏈服務(wù)有限公司；谷殼，瀘州市龍馬潭區(qū)永福米廠；高溫大曲，瀘州市醇香生物制造有限公司；河內(nèi)白曲，山東梁山徐坊大曲有限公司；糖化曲，安琪酵母股份有限公司。試驗地點選在瀘州某酒廠生產(chǎn)車間。

試劑及耗材：氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，；2-辛醇，色譜純，Sigma-Aldrich；購自聚合化工。

儀器設(shè)備：TL2010S 中通量組織研磨儀，北京鼎昊源科技有限公司；SP-756P 紫外可見分光光度計，上海屹譜儀器有限公司；MLS-375L 全自動滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9245A 烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-1 電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程圖

圖1 工藝流程圖

1.2.2 實驗設(shè)計

1.2.3 取樣

每個方案同時做3 口一樣大小（3.2 m×2.4 m×1.8 m）的平行窖池，取堆積前、入窖、出窖三個時間點的樣品，將統(tǒng)一方案的3 口窖池所采樣品置于無菌取樣袋中立即密封混合均勻，再將其分為2份，1份保存在-20 ℃用于理化特性檢測，1 份保存在-80 ℃用于基因組DNA提取。

1.2.4 理化指標(biāo)檢測

理化指標(biāo)檢測參照書目《白酒分析與檢測技術(shù)》和《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》中的步驟[7-8]。

1.2.5 DNA提取方法

稱取10 g 糟樣，用SDS[9]提取糟醅樣品中微生物的基因組DNA?；蚪MDNA 送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)在美吉生物云平臺(https:l/lcloud.majorbio.com/)進(jìn)行處理。

1.2.6 基酒感官嘗評方法

基酒感官品評方法參考國標(biāo)GB/T 33404—2016[10]、GB/T 33405—2016[11]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性檢驗分析，根據(jù)高通量擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)，利用PICRUSt2(v2.2.0-b)對標(biāo)記基因（16S/ITS）序列進(jìn)行功能豐度預(yù)測，獲得每個樣本中對應(yīng)的功能信息和豐度信息，并采用origin2018以及R語言進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

不同方案堆積、入窖、出窖糟醅水分、酸度、還原糖、淀粉含量如圖2 所示。糟醅水分含量為52.6%～59.5%，發(fā)酵過程中每個方案的水分都呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，變化差異顯著，加麩皮在堆積過程中對水分消耗相對較大。3個方案的酸度變化差異顯著，加麩皮能夠增加溶氧，在堆積過程中酸能夠快速被微生物代謝分解，在發(fā)酵過程中又能顯著增加。從圖2 可以看出，方案1 和方案3 堆積和發(fā)酵前后酸度變化差異最大，方案1 堆積前酸度最大，堆積后降為最小，發(fā)酵結(jié)束后又升至最大，方案2 在堆積和發(fā)酵前后酸度變化差異最小。3 種方案的還原糖和淀粉含量變化趨勢基本一致，差異不明顯，在堆積前后，方案2 還原糖含量增加相對大于方案1 和方案2，發(fā)酵前后，方案3 中淀粉含量消耗最大，方案1和方案2次之。

圖2 3種方案理化指標(biāo)

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 糟醅微生物多樣性分析

對3 個不同方案糟醅樣品的ASV（Amplicon Sequence Variant）集、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)進(jìn)行比較分析（表2），可以看出，Chao1 和Shannon 指數(shù)都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，方案1 和方案3 中細(xì)菌堆積前后豐富度變化巨大，表明加入麩皮能夠極大地降低細(xì)菌的多樣性，對真菌卻影響不顯著；方案2 整體變化相對較小；真菌堆積前后豐富度變化并不明顯，在發(fā)酵過程中增加。

表2 不同方案的原核和真核微生物菌群多樣性指數(shù)

2.2.2 不同方案糟醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對比分析

糟醅原核微生物群落組成（＜1 %合并為Others)如圖3 所示，不同方案中共檢出18 種優(yōu)勢細(xì)菌，細(xì)菌種類組成相似，豐度存在差異。從整體上來看，3 種方案在堆積和發(fā)酵結(jié)束時，入窖和出窖糟醅的細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似，優(yōu)勢微生物分別為醋酸桿菌屬（Acetobacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），豐度超過90 %；不同點更多在于堆積過程，通過對比D1、D2 和D3，不難發(fā)現(xiàn)，D1 和D3 的細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有相似性，可能是由于都加有麩皮所導(dǎo)致，差別在于D3 中克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)豐度顯著高于D1；相較于D1 和D3，D2中Lactobacillus和芽孢桿菌屬（Bacillus）的豐度更小，糖多孢菌屬（Saccha-ropolyspora）和Solitalea的豐度更大。對比R1、R2和R3，在堆積過程中加麩皮能夠顯著增加疏松度，使得溶氧增加，好氧微生物的豐度顯著大于不加麩皮；在C3 中還存在一定量的Acetobacter，表明在方案3 的整個發(fā)酵過程中，Acetobacter因麩皮的增氧屬性，一直參與整個釀造過程。從配料差異分析，河內(nèi)白曲和糖化曲在堆積前后對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小，麩皮影響較大。

圖3 不同方案堆積、入窖和出窖糟醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.3 不同方案糟醅真菌群落結(jié)構(gòu)對比分析

糟醅真核微生物群落組成（＜1 %合并為Others)如圖4 所示，不同方案中共檢出22 種優(yōu)勢真菌，且真菌種類和豐度都存在顯著差異。對比發(fā)現(xiàn)，在堆積前，方案1 的真菌優(yōu)勢微生物為嗜熱真菌屬（Thermomyces89 %），方案2為Thermomyces13 %和曲霉屬（Aspergillus76 %），方案3 為絲衣霉屬（Byssochlamys12 %）、Thermomyces31 %、Aspergil-lus16%、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus30%）。堆積后，方案1 中優(yōu)勢微生物以酵母屬為主，包括伊薩酵母屬（Issatchenkia29 %）、畢赤酵母屬（Pichia29 %）以及哈薩克斯坦酵母（Kazachstania25 %）；方案2 優(yōu)勢微生物以Byssochlamys98%為主；方案3 優(yōu)勢真菌微生物為Byssochlamys87 %和Issatchenkia10 %。出窖后，方案1 優(yōu)勢微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括Byssochlamys8.8 %、Thermomyces2.6 %、Aspergillus7.9 %、Issatchenkia27 %、Pichia 15%、青霉菌屬（Penicillium4.2%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia7.4 %）、Thermoascus3.1 %；方案2 真菌微生物種類呈多元化，其中優(yōu)勢微生物為Byssochlamys2.7 %、Thermomyces2.4 %、Aspergillus6.9 %、Issatchenkia9 %、Penicillium9.5 %、Pichia4.7 %、Wallemia23 %；方案3 優(yōu)勢微生物包括Byssochlamys14%、Aspergillus6%和Penicillium52%。

圖4 不同方案堆積、入窖和出窖糟醅真菌群落結(jié)構(gòu)

對比3 種方案，從微生物的種類、多樣性和豐度進(jìn)行討論，在堆積前期，不同種曲藥使優(yōu)勢真菌微生物群落結(jié)構(gòu)差異巨大；堆積過后，方案1 的優(yōu)勢微生物主要集中在酵母屬，方案2 和方案3 的優(yōu)勢微生物主要集中在霉菌屬；發(fā)酵結(jié)束后，各方案中真菌微生物種類基本一致，豐度各有不同。可見，不同種曲藥對整個發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)的影響要遠(yuǎn)大于輔料對白酒釀造的影響。值得注意的是，優(yōu)勢微生物Thermomyces能夠產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和脂肪酶等酶類，為酵母的生長提供了重要動力，同時還能產(chǎn)生蛋白酶，為美拉德反應(yīng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，故該菌在白酒釀造過程中有著重要的作用[12-13]；Aspergillus能夠合成纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶，還能合成有機(jī)酸[14-15]，這可能是方案2 在堆積過程中酸度降幅最小以及在堆積結(jié)束時Byssochlamys成為優(yōu)勢微生物的原因之一。

2.3 微生物代謝通路及主要代謝功能分析

通過圖5 分析可見，代謝通路占比最大，3 個方案之間差異較大，方案1 和方案3 呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，方案2 呈現(xiàn)持續(xù)減少的趨勢。具體通過圖6 可以看出，在方案1、方案2 以及方案3 的代謝功能豐度對比中，可以明顯看出，方案2 要大于方案1 和方案3。在氨基酸、輔酶和無機(jī)離子代謝中，堆積后方案1 和方案3 豐度顯著增加，在發(fā)酵階段顯著降低，方案2 呈減小趨勢，表明加入麩皮確實能夠在堆積階段顯著增加氨基酸、輔酶以及無機(jī)離子的代謝。然而通過對比發(fā)現(xiàn)，方案1 和方案3 在堆積過程中氨基酸、輔酶以及無機(jī)離子的COG 代謝豐度相較于方案2 更小，表明加入麩皮，糟醅中空隙增加的同時也使得細(xì)菌微生物的平均豐度降低，從而在堆積前COG 代謝功能豐度降低，進(jìn)一步表明方案2 對含氮類物質(zhì)的代謝消耗更多。在碳水化合物的代謝中，方案1 和方案3 在堆積前后變化不大，在發(fā)酵過程中，逐漸增加；方案2 隨著釀造時間的增加，碳水化合物的代謝途徑呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢,表明方案1 和方案3 中的細(xì)菌微生物對淀粉、糖等物質(zhì)的消耗速度一直在增加，方案2在堆積過程中細(xì)菌微生物對淀粉、糖等物質(zhì)的消耗速度逐漸降低，在發(fā)酵過程中逐漸增加，堆積前的代謝豐度卻大于方案1 和方案3。結(jié)合圖2 可以看出，在入窖和出窖糟醅中，3 種方案的優(yōu)勢細(xì)菌微生物都是Acetobacter和Lactobacillus，且豐度相差比不顯著，說明3 種方案發(fā)酵過程中細(xì)菌微生物對淀粉、糖等的消耗速度基本一致，在堆積前后存在較大差異。

圖5 各方案堆積和發(fā)酵前后細(xì)菌微生物群落KEGG通路分布

圖6 各方案堆積和發(fā)酵前后細(xì)菌微生物群落主要COG代謝功能分布

2.4 基礎(chǔ)酒感官嘗評結(jié)果分析

組織專家對三個試驗方案三個輪次共九個綜合酒樣進(jìn)行感官品評,對每個試驗方案的三個酒樣分?jǐn)?shù)進(jìn)行綜合平均排序，專家組由4 名釀酒專家和6 名品酒專家組成，白酒感官品評嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33404—2016 進(jìn)行，評分細(xì)則主要包括：色澤（5分）、香氣（25分）、口感（60分）、風(fēng)格（10分）四個方面。專家組給出的綜合平均結(jié)果如表3所示。

表3 基礎(chǔ)酒綜合樣對比品評記錄表

對評價結(jié)果繪制風(fēng)味雷達(dá)圖如圖7所示。

圖7 基酒感官評價雷達(dá)圖

結(jié)合基礎(chǔ)酒的品評結(jié)果及圖7 可以分析總結(jié)出，經(jīng)過高溫堆積、入窖發(fā)酵、量質(zhì)摘酒、長期儲存等釀酒工藝后，所釀基礎(chǔ)酒在色澤、香氣、口感、風(fēng)格等方面融合了濃香型、醬香型白酒風(fēng)格之長，特點突出、復(fù)合優(yōu)雅。三實驗方案三個輪次共9 個酒樣的酒體皆表現(xiàn)為無色或微黃透明、復(fù)合感強(qiáng)、風(fēng)格獨特，特別是方案F1（高溫大曲+糖化曲）放置一年以后的基礎(chǔ)酒酒體顏色明顯微黃，醇厚綿甜、豐滿協(xié)調(diào)、具有非常舒適優(yōu)雅的復(fù)合香氣。

3 結(jié)論

通過對釀造過程中微生物多樣性、代謝通路以及基酒的感官品評，發(fā)現(xiàn)不同方案之間差異巨大。方案2（高溫大曲+糖化曲）的評價結(jié)果優(yōu)于方案1（高溫大曲+河內(nèi)白曲+麩皮）和方案3（高溫大曲+糖化曲+麩皮）。通過多輪次實驗，最終確定方案2更適用于特殊香型白酒的釀造。通過研究不同香型的工藝融合，分析不同工藝配料發(fā)酵過程的理化、風(fēng)味、微生物以及白酒品質(zhì)之間的關(guān)系來不斷優(yōu)化調(diào)味酒釀造工藝，為豐富中國白酒調(diào)味酒種類，創(chuàng)新傳統(tǒng)中國白酒的生產(chǎn)工藝以及滿足消費者多元化需求奠定了堅實基礎(chǔ)。