金環(huán)胡蜂蜂房總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析

王振吉 楊申明 段德珊 徐文麗 楊依柯

（楚雄師范學院 資源環(huán)境與化學學院，楚雄 675000）

蜂房（Nidus vespae），又稱露蜂房、馬蜂窩、蜂巢等，藥用價值較高，具有祛風、殺蟲、止痛、抗過敏等功效，民間常用來治療瘡瘍腫毒、乳癰、鵝掌風和過敏性體質等病癥[1-3]。蜂房中含有酚酸類、黃酮類、萜類及酯類等化合物[4]。研究表明，蜂房具有多種生理活性，在動物生產(chǎn)和飼料工業(yè)等領域中具有廣泛的應用前景[5-8]。

金環(huán)胡蜂（Vespa mandarinia）為膜翅目（Hymenoptera）胡蜂科（Vespidae）胡蜂屬（Vespa）中體型最大、性情兇猛捕食性肉食昆蟲[9]，其幼蟲、全體、蜂毒、蜂房均可入藥，藥材名大黃蜂子、大黃蜂、蜂巢，主治風濕痹痛，是一種民間中藥[10]。目前，大部分金環(huán)胡蜂蜂房被丟棄，造成了資源極大浪費。黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性[11,12]，若能從金環(huán)胡蜂蜂房中提取黃酮類物質，并用于動物生產(chǎn)和飼料工業(yè)領域中，對開發(fā)利用金環(huán)胡蜂資源具有重要意義。目前，有關VMNTF 的提取及抗氧化性的研究鮮見報道。為此本研究以金環(huán)胡蜂蜂房為材料，利用超聲輔助酶協(xié)同提取VMNTF，通過測定VMNTF 對Fe3+還原能力和·OH、DPPH·的清除能力來評價抗氧化性，旨在為VMNTF 在動物生產(chǎn)和飼料工業(yè)等領域中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金環(huán)胡蜂蜂房產(chǎn)自云南楚雄，由楚雄師范學院王振吉教授鑒定為金環(huán)胡蜂的巢，蜂房烘干（60℃）、粉碎后過40 目篩，得干粉，備用；蘆丁標準品（HPLC＞98%），由索萊寶公司生產(chǎn)，其他化學試劑均為AR，由成都金山化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備

準確稱取1.00 g 金環(huán)胡蜂蜂房、0.02 g 纖維素酶放入250 mL 錐形瓶中，加入60 mL 體積分數(shù)55%乙醇溶液，密封后放入超聲波中，在60 ℃的超聲波中超聲70 min 后，將金環(huán)胡蜂蜂房提取液進行抽濾，濾液用體積分數(shù)55%乙醇定容至100 mL 容量瓶中，得金環(huán)胡蜂蜂房提取液。

1.2.2 VMNTF 成分的鑒定

取5 份2 mL 金環(huán)胡蜂蜂房提取液，分別加入質量分數(shù)4%NaOH、1%AlCl3-CH3CH2OH、鹽酸-鎂粉、濃硫酸和質量分數(shù)5%FeCl3溶液各1mL 進行反應，檢識黃酮類物質的有無[13,14]。

1.2.3 VMNTF 含量測定

以蘆丁為標準品，參考文獻[15]的方法繪制標準曲線，按式（1）計算總黃酮提取量。

式（1）中：C 為所測VMNTF 的濃度（g.mL-1）；N 為提取液稀釋倍數(shù)；V 為提取液體積（mL）；M 為金環(huán)胡蜂蜂房粉末的質量（g）。

1.2.4 提取工藝單因素試驗

選擇乙醇體積分數(shù)分別為35%、40%、45%、50%、55%的條件下進行提取，液料比30∶1（mL/g），超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，纖維素酶用量2%；確定了乙醇體積分數(shù)55%提取VMNTF 效果較好后，在不同超聲溫度45、50、55、60、65 ℃的條件下提取VMNTF，液料比為30∶1（mL/g），超聲時間為60 min，纖維素酶用量為2%；確定了超聲溫度55 ℃提取VMNTF 效果較好后，在液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）的條件下進行提取，乙醇體積分數(shù)55%，超聲時間60 min，纖維素酶用量2%；確定了液料比50∶1（mL/g）提取VMNTF 效果較好后，在不同超聲時間60、70、80、90、100 min 的條件下提取VMNTF，乙醇體積分數(shù)55%，超聲溫度55 ℃，纖維素酶用量2%，確定不同超聲時間的影響。

1.2.5 VMNTF 最佳提取工藝條件優(yōu)化

以VMNTF 提取量為評價指標，在考察單因素試驗的基礎上，采用L9(34)試驗優(yōu)化VMNTF 提取工藝條件。試驗因素及水平如表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.6 VMNTF 提取量測定

準確稱取1.00g 蜂房樣品5 份，在實驗優(yōu)化后的較佳條件下提取VMNTF，計算VMNTF 平均提取量及相對標準偏差（RSD）。

1.2.7 VMNTF 抗氧化活性測定

將VMNTF 溶液配制為0.01288、0.02576、0.03864、0.05152、0.06440 mg·mL-15 種不同質量濃度，測定其抗氧化性。

（1）VMNTF 對Fe3+還原能力測定

參考文獻[16]的方法，稍作修改。取不同質量濃度VMNTF 提取液1.0 mL，加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）2.0 mL 和質量分數(shù)1%鐵氫化鉀溶液2.0 mL，在50 ℃水浴中恒溫20 min，冷至室溫后加入2.0 mL 質量分數(shù)10%三氯乙酸，離心后取上層清液2.0 mL 加入蒸餾水2.0 mL 和0.5 mL 質量分數(shù)0.1%三氯化鐵，室溫反應10 min 后用超純水調零，在波長700 nm處測定吸光度值，吸光度值的大小表示樣品還原能力的強弱。同時，以同質量濃度藥VC 作陽性對照。

（2）VMNTF 對·OH 清除率測定

參考文獻[17]的方法，稍作修改。取不同質量濃度VMNTF 提取液2.0 mL，依次分別加入9 mmol/L 硫酸亞鐵、9 mol/L 水楊酸-乙醇溶液和9 mmol/L H2O2各2.0 mL，在37 ℃水浴中反應30 min，冷至室溫，離心，取上層清液，用蒸餾水調零，在510 nm 處測定吸光度記Ax。用2.0 mL 蒸餾水代替VMNTF 提取液按上述操作測定吸光度記A0。取不同質量濃度VMNTF 提取液2.0 mL，加入6.0 mL 蒸餾水，搖勻，置于37 ℃水浴中恒溫30 min，冷至室溫，離心，取上層清液，用蒸餾水調零，在510 nm 處測定吸光度記Ax0。同時，以同質量濃度藥VC 作陽性對照，·OH 清除率按式（2）計算。

（3）VMNTF 對DPPH·清除率測定

參考文獻[18,19]的方法測定不同質量濃度VMNTF對DPPH·清除率，以同質量濃度藥VC 作陽性對照，DPPH·清除率按式（3）計算。

式（3）中：Ai為DPPH-乙醇溶液和不同質量濃度VMNTF 提取液吸光度；Ac為DPPH-乙醇與無水乙醇混合溶液吸光度；Ab為無水乙醇與不同質量濃度VMNTF 吸光度。

2 結果與分析

2.1 VMNTF成分的鑒定

金環(huán)胡蜂蜂房中黃酮類物質顯色反應結果見表2，表明金環(huán)胡蜂蜂房提取液中含有黃酮類化合物。

表2 總黃酮成分鑒定表

2.2 蘆丁標準曲線

蘆丁質量濃度標準曲線見圖1，其回歸方程為A=10.913C-0.0085（相關系數(shù)R2=0.9998），線性范圍為0.008～0.04 mg.mL-1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.3 單因素試驗結果

乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比、超聲時間對VMNTF 提取效果的影響見圖2。

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對VMNTF 提取效果的影響

在液料比30∶1（mL/g）、超聲溫度50 ℃、超聲時間60 min、纖維素酶用量2%條件下，考察乙醇體積分數(shù)對VMNTF 提取量的影響，結果見圖2A，從圖2A 可以看出，在考察的乙醇體積分數(shù)35%～75%范圍內，VMNTF 的提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增大呈先增大后減小的趨勢，乙醇體積分數(shù)為55%時，VMNTF提取量最大為15.937 mg·g-1，之后繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，VMNTF 提取量逐步減小，因此適宜乙醇體積分數(shù)在55%附近。

2.3.2 超聲溫度對VMNTF 提取效果的影響

在乙醇體積分數(shù)55%、液料比30∶1（mL/g）、超聲時間為60 min、纖維素酶用量為2%的條件下，考察不同超聲溫度對VMNTF 提取量的影響，結果見圖2B，從圖2B 可以看出，超聲溫度在45～65℃時，VMNTF 的提取量隨超聲提取溫度的不斷升高呈先增大后減小的趨勢，當超聲溫度升高到55 ℃時，VMNTF提取量達到最大16.125 mg·g-1，之后隨著超聲溫度的升高VMNTF 提取量有減小的趨勢，因此適宜超聲溫度在55 ℃附近。

2.3.3 液料比對VMNTF 提取效果的影響

在乙醇體積分數(shù)為55%、超聲溫度為55 ℃、超聲時間為60 min、纖維素酶用量為2%條件下，考察不同液料比對VMNTF 提取效果的影響，結果見圖2C，從圖2C 可以看出，液料比在30∶1～70∶1（mL/g）時，VMNTF 提取量呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，在液料比為50∶1 時，VMNTF 提取量達到最大為19.025 mg·g-1，之后隨著液料比的增大，VMNTF 提取量逐步減小，因此適宜液料比在50∶1（mL/g）附近。

2.3.4 超聲時間對VMNTF 提取效果的影響

在乙醇體積分數(shù)55%、超聲溫度55 ℃、液料比50∶1（mL/g）、纖維素酶用量2%條件下，考察超聲時間對VMNTF 提取效果的影響，結果見圖2D，從圖2D 可以看出，超聲時間在50～100 min 時，VMNTF 提取量呈先增大后減小的趨勢，在超聲時間為80 min 時，VMNTF 提取量達到最大為16.312 mg·g-1，之后隨著超聲時間的增加，VMNTF 提取量逐步減小，因此適宜超聲時間在80 min 附近。

2.4 正交試驗結果

結果見表3，從表3 分析可知，不同提取條件對VMNTF 提取量影響程度不同，影響VMNTF 提取量大小順序依次是超聲溫度＞液料比＞超聲時間＞乙醇體積分數(shù)。由極差分析得到較佳VMNTF 提取工藝條件組合為A2B3C3D1，即最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)55%，超聲溫度60 ℃，液料比60∶1（mL/g），超聲時間70 min，纖維素酶用量2%。

表3 正交試驗結果

2.5 VMNTF平均提取量測定結果

結果見表4，從表4 可知，VMNTF 平均提取量為20.132 mg·g-1，大于正交試驗中VMNTF 最大提取量20.125 mg·g-1，RSD 為0.95%，表明本方法對VMNTF提取量測量準確度較高。

表4 VMNTF平均提取量測定結果

2.6 VMNTF抗氧化活性分析

2.6.1 對Fe3+還原能力的評價

VMNTF 還原能力隨質量濃度的變化見圖3。由圖3 可知，在VMNTF 質量濃度為0.01288～0.06440 mg·mL-1范圍內，VMNTF 的還原能力隨濃度的增大而增強。當其質量濃度為0.06440 mg·mL-1時，使Fe3+還原產(chǎn)生的吸光度值為1.262，比陽性對照品藥維生素C 的還原能力強（吸光度值為0.521），這表明VMNTF對Fe3+具有很強的還原能力。

圖3 不同質量濃度VMNTF與VC對Fe3+的還原能力

2.6.2 清除·OH 能力評價

VMNTF 對·OH 清除效果隨質量濃度的變化見圖4。由圖4 可知，VMNTF 質量濃度在0.01288～0.06440 mg·mL-1范圍內，清除·OH 的能力隨著VMNTF 質量濃度的增大而增強。當VMNTF 質量濃度為0.06440 mg·mL-1時，對·OH 的清除率為94.46%，其清除能力明顯大于同質量濃度的陽性對照品藥維生素C（清除率為60.49%），這說明VMNTF 具有很強的清除·OH的能力。

圖4 不同質量濃度VMNTF與VC對·OH的清除效果

2.6.3 清除DPPH·能力評價

VMNTF 對DPPH·清除效果隨質量濃度的變化見圖5。由圖5 可知，VMNTF 質量濃度在0.01288～0.06440 mg·mL-1范圍內，隨著VMNTF 質量濃度增大，清除DPPH·能力增強。當VMNTF 質量濃度為0.06440 mg·mL-1時，對DPPH·的清除率為95.02%，其清除能力明顯大于同質量濃度的陽性對照品藥維生素C（清除率為87.53%），說明VMNTF 具有較強的清除DPPH·的能力。

圖5 不同質量濃度VMNTF與VC對DPPH·的清除效果

3 結論

以云南楚雄金環(huán)胡蜂蜂房為原材料，VMNTF 得率為評價指標，在單因素實驗基礎上，結合正交試驗分析法優(yōu)化得到VMNTF 最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)55%、超聲溫度60 ℃、液料比60∶1（mL/g）、超聲時間70 min、纖維素酶用量2%，在此條件下VMNTF平均提取量為20.132 mg·g-1，RSD 為0.95%，該方法適合VMNTF 提取和含量測定。

該研究從Fe3+還原能力、·OH 和DPPH·的清除能力3 個方面來分析VMNTF 的抗氧化性，結果表明：當VMNTF 質量濃度在0.01288～0.06440 mg·mL-1時，對Fe3+還原能力和·OH、DPPH·的清除率均隨著VMNTF 質量濃度的增大而增大。當VMNTF 質量濃度為0.06440 mg·mL-1時，使Fe3+還原產(chǎn)生的吸光度為1.262，大于陽性對照品藥維生素C 使Fe3+還原產(chǎn)生的吸光度（0.521）；對·OH、DPPH·清除率分別為94.46%和95.02%，均大于陽性對照品藥維生素C對·OH（清除率60.49%）、DPPH·（清除率87.53%）的清除率，說明VMNTF 具有較強的抗氧化性，其抗氧化性強于對照品藥維生素C。因此，VMNTF 具有開發(fā)成為天然抗氧化劑的潛能。