基于代謝組學(xué)對(duì)延安五倍子蜂蜜特征物篩選的研究

張馮斌 方?jīng)_偉 李斌 馬玉蓮 康科 王鑫 吳黎明

（1 黃龍縣養(yǎng)蜂試驗(yàn)站；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所）

五倍子蜂蜜屬于中藥蜜的一種，采自漆樹科落葉小喬木的五倍子花蜜，未結(jié)晶時(shí)呈質(zhì)地濃稠、光澤的琥珀色或深琥珀色，具有五倍子花特有的自然香味，味道有一絲絲苦味和中藥材味，作為中藥蜜種，五倍子蜂蜜具有調(diào)理腸胃、解毒、殺菌和清熱去火等作用，備受市場認(rèn)可，其市場需求量逐年增加。五倍子蜜屬于稀有蜜種，產(chǎn)量不及油菜蜜、洋槐蜜和荊條蜜等國內(nèi)主要蜜種，售價(jià)高于普通蜂蜜[1]。

陜西延安地區(qū)以獨(dú)特的地理資源優(yōu)勢，生長有多種蜜源植物，其中就有豐富的五倍子。延安地區(qū)的五倍子蜂蜜品質(zhì)優(yōu)良，深受消費(fèi)者青睞。然而，近來一些不良商家受到利益驅(qū)使，將與五倍子蜂蜜色澤相近的低價(jià)蜂蜜冒充高價(jià)的五倍子蜂蜜進(jìn)行銷售，這種“以次充好”的造假方式不僅從外觀上很難區(qū)分，非五倍子蜂蜜冒充五倍子蜂蜜的現(xiàn)象對(duì)延安地區(qū)五倍子蜂蜜聲譽(yù)構(gòu)成了威脅，并且極大損害了消費(fèi)者利益。

蜂蜜中酚類化合物總量約有56～500 mg/kg，蜂蜜中這些植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅賦予其多種活性功能[2]，如抗氧化、抗炎和抗菌等，除此以外，蜂蜜中的酚類化合物也是重要的植物源和地理源標(biāo)志物。1991年，F(xiàn)erreres 等9 位學(xué)者證明[3]，可以通過鑒定蜂蜜酚酸和黃酮的成分和含量來確定蜂蜜的花源和地理起源。荊條蜜中主要是皂草黃素，槲皮素是向日葵花蜜的特征性成分，沒食子酸是石楠花蜜的特征性成分，橙皮素是柑桔蜜中的特征性成分[4]。

本研究主要以延安地區(qū)的五倍子蜂蜜為研究對(duì)象，通過與多花蜂蜜比較分析其中的酚類化合物，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出延安地區(qū)五倍子蜂蜜的特征化合物，進(jìn)一步建立特征化合物的準(zhǔn)確定量方法，為該地區(qū)五倍子蜂蜜的質(zhì)量控制提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用五倍子蜂蜜、百花蜜，于2021年收集于延安當(dāng)?shù)胤鋱?，?shí)驗(yàn)用水為純凈水杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司、甲醇（LC-MS級(jí)，美國Merk公司）、乙腈（LC-MS級(jí)，美國Merk 公司），水為超純水（Milli-Q SP Regent Water system，美國）碘（分析純）：天津永晟精細(xì)化工有限公司；碘化鉀（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙酸鈉、可溶性淀粉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸（色譜純）：美國TEDIA公司；氯化鈉（分析純）、乙腈（色譜純）：北京Dikma 公司；羥甲基糠醛（分析純）：日本Sigma 公司；果糖、葡萄糖、麥芽糖（分析純）：Aladdin 公司；蔗糖（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

美國安捷倫公司6560 系列；超聲波清洗機(jī)：AS3120A 型，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；電子天平：FA22048 型，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Gradient）：美國MILLIPORE 公司；WSTERS2690 超高壓液相色譜儀：沃特世公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2600）：蘇州島津儀器有限公司；阿貝折光儀（ARIAS500）：美國REICHERT 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 五倍子蜂蜜理化指標(biāo)的檢測

蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量根據(jù)國標(biāo)GB 5009.8-2016 方法測定[5]：稱取混勻后的試樣1 g～2 g（精確到0.001 g）于50 mL 容量瓶，加水定容至50 mL，充分搖勻，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm 微孔濾膜過濾或離心獲取。上清液過0.45 μm 微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析[6]。

蜂蜜中的水分根據(jù)商檢行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0852-2012 測定[7]：在測定前先將棱鏡擦洗干凈，以免留有其他物質(zhì)影響測定精度。用玻璃棒蘸取混勻的試樣1～2 滴，滴于下面的棱鏡上，迅速閉合棱鏡，靜置數(shù)秒鐘，以待樣品達(dá)到40℃對(duì)準(zhǔn)光源，由目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)補(bǔ)償器螺旋，使明暗分界線清晰；轉(zhuǎn)動(dòng)標(biāo)尺指針螺旋，使其明暗分界線恰好通過接物鏡上十字線的交點(diǎn)。讀取標(biāo)尺上的折光指數(shù)，同時(shí)核對(duì)溫度，恰為40℃[8]。

蜂蜜中淀粉酶活性根據(jù)國標(biāo)GB/T 18932.16-2003 測定[9]：淀粉酶活性檢測采用GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的測定方法分光光度法》規(guī)定的方法檢測。將配制好的淀粉溶液與處理過的樣品溶液充分混勻，在40℃水浴條件下，部分淀粉被蜂蜜溶液中的淀粉酶水解后，剩余淀粉與碘反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)紫色，隨著淀粉酶水解作用，藍(lán)紫色反應(yīng)逐漸消失，用分光光度計(jì)于660 nm 波長處測定吸光度達(dá)到0.235 時(shí)所需時(shí)間，換算出樣品中淀粉酶值[10]。

蜂蜜中羥甲基糠醛含量根據(jù)國標(biāo)GB/T 18932.18-2003 測定[11]：稱取10 g 試樣，精確至0.01 g，置于100 mL 燒杯中，加入10 mL 甲醇，用玻璃棒輕輕攪拌均勻，使試樣完全溶解。轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用水釋稀至刻度，充分混勻。用0.45 μm 的濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測器測定[12]。

1.3.2 蜂蜜酚類化合物分析方法

蜂蜜樣品前處理方法：稱取5 g 蜂蜜，加5 ml 水，渦旋2 min；加入10 ml 乙腈，渦旋2 min，視情況超聲或增加渦旋時(shí)間促進(jìn)結(jié)晶蜂蜜的溶解；加入QuEChERs Extract pouch，EN Method 5982-0650（安捷倫內(nèi)部小包裝貨號(hào)），渦旋2 min；4℃，8000 rpm，離心10 min，取全部上清（8 ml 左右，取一致）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35～40℃，2500rpm，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至微干；復(fù)溶：用1 mL甲醇復(fù)溶，上機(jī)[13]。

酚類化合物儀器分析方法：采用安捷倫超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QqQ-MS/MS)對(duì)鑒定的標(biāo)記物進(jìn)行定量分析[14]。色譜條件：采用雙溶劑體系，流動(dòng)相A 為超純水，0.1%(v/v)甲酸，流動(dòng)相B 為乙腈。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序每次運(yùn)行開始在5% B 和B 1 分鐘保持在5%，那么B 在2 分鐘增加到35%，35%到50%的B 從2 到3 分鐘，50%到75%的B 3 到5 分鐘，75%到100%的B 從5 到5.1 分鐘，并保持在100% B 從5.1 到7 分鐘，然后B 7.1分鐘下降到5%，保持在5% B 從7.1 到10.0 分鐘，發(fā)布時(shí)間是3 分鐘。洗脫液從0 到0.5 分鐘轉(zhuǎn)向。柱恒溫器保持在40℃。質(zhì)譜條件：對(duì)于質(zhì)譜分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，在正電離模式下采集。電噴霧電離(ESI)設(shè)置如下：干氣溫度，200℃；干氣流量，15 L/min；噴霧器壓力，45 psi；護(hù)套氣溫330℃；鞘氣流量，12 L/min；噴嘴電壓1.5 kV；毛細(xì)管電壓，3.5 kV[15]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

多元統(tǒng)計(jì)分析是用SIMCA 軟件實(shí)施的。主成分分析（PCA）、聚類分析和正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA）是被用來區(qū)分五倍子蜂蜜和多花蜂蜜樣品。VIP 值1（p＜0.05）的因子是通過OPLS 模型提取出的能顯著區(qū)分不同蜂蜜樣品的因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子蜂蜜理化指標(biāo)分析結(jié)果

延安五倍子蜂蜜相關(guān)常規(guī)理化指標(biāo)如表1所示，果糖和葡萄糖含量、淀粉酶活性顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定指標(biāo)（P＜0.05），水分遠(yuǎn)低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，蔗糖未檢出，延安五倍子蜂蜜相關(guān)理化指標(biāo)符合蜂蜜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T18796-2012 的一級(jí)品指標(biāo)[16]。試驗(yàn)所測蜂蜜樣品成熟度較高，且品質(zhì)較好。

表1 五倍子蜂蜜理化指標(biāo)

2.2 五倍子蜂蜜酚類化合物分析結(jié)果

我們首先對(duì)所收集的五倍子蜂蜜和多花蜂蜜樣品的酚類化合物進(jìn)行分析。五倍子蜂蜜和多花蜂蜜中的酚類化合物主要有沒食子酸、原兒茶醛、4-羥基苯甲酸、楊梅素、咖啡酸、香草酸、桑色素、阿魏酸、木犀草素、槲皮素、短葉松素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、山奈酚、香葉木素、異鼠李素、芒柄花黃素、松屬素、毛蕊異黃酮、次黃岑素和柯因等。進(jìn)一步根據(jù)這些蜜樣中的酚類化合物分布進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析以區(qū)分五倍子蜂蜜和多花蜂蜜樣品。

主成分分析（PCA）是一種無監(jiān)督學(xué)習(xí)算法，它通過將變量投影到具有最大方差的主成分來降低數(shù)據(jù)的維數(shù)，從而達(dá)到多元統(tǒng)計(jì)分析的目的。它可以作為樣品分類前的第一步，揭示變量之間和樣本之間的關(guān)系，檢測異常值。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，它可以過濾矩陣中的無關(guān)變量，最大限度地提高不同樣本之間的差異，凸顯組間差異[17]。

利用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析基于降維原理簡化數(shù)據(jù)后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，可用于不同品種、不同加工方式等的化學(xué)識(shí)別及歸類。由PCA散點(diǎn)圖可知（圖1-A），基于酚類化合物的分布可將五倍子蜂蜜樣品與百花蜜樣品顯著區(qū)分。進(jìn)一步，通過OPLS-DA 散點(diǎn)圖（圖1-B）也清楚顯示五倍子蜂蜜及百花蜜樣品分別分布于兩個(gè)不同區(qū)域，說明這兩類蜂蜜樣品酚類化合物組成存在較大差異。聚類分析也將兩類蜂蜜有效區(qū)分，如圖1-C所示。進(jìn)一步，通過OPLS-DA映射圖（圖1-D），可以篩選出區(qū)分兩類蜂蜜樣品的重要酚類化合物，圖1-C 的峰值和圖1-D 的分布看出兩樣品中特征物的差異，這些主要的差異化合物列在表2中，主要包括16 種化合物。VIP 值越大，表明對(duì)五倍子蜂蜜和多花蜂蜜的區(qū)分貢獻(xiàn)越大。其中篩選出次黃岑素并通過在實(shí)際樣品中進(jìn)一步驗(yàn)證，確定在五倍子蜂蜜中其含量遠(yuǎn)高于多花蜜中的含量，可作為潛在的延安地區(qū)五倍子蜂蜜的特征酚類化合物。

圖1 基于酚類化合物的多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 基于OPLS-DA篩選出五倍子蜂蜜和多花蜂蜜的酚類差異化合物

2.3 五倍子蜂蜜中次黃岑素定量分析方法的建立

串聯(lián)質(zhì)譜適合對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。我們擬通過建立UHPLC-MS/MS 方法[18]來準(zhǔn)確定量五倍子蜂蜜中的次黃岑素。選取濃度為0.1 mg/L 的次黃岑素標(biāo)品，用于優(yōu)化儀器測定條件。首先通過全掃描模式確定283.0 為母離子，合適的碎裂電壓為380 V。在10 eV、15 eV、20 eV、25 eV 和30 eV 這些測試的碰撞能量中，20 eV（268.1 m/z）和25 eV（239.8 m/z）產(chǎn)生的子離子豐度最高。

以m/z 268.1 為定量離子，m/z 239.8 為定性離子，次黃岑素的保留時(shí)間是5.0 min。將次黃岑素標(biāo)品逐級(jí)稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0006x+25419（R2=0.9993），其中x 和y 分別代表次黃岑素的濃度和峰面積。在0.02～0.50 mg/L 范圍內(nèi)，次黃岑素的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系。在0.05 mg/L 的濃度下，次黃岑素的平均回收率為92.8%～101.2%，且RSD＜2%，表明該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好。次黃岑素的LOD 和LOQ 分別為5 μg/kg 和20 μg/kg。

基于所建立的UHPLC-MS/MS 方法測定五倍子蜂蜜和多花蜂蜜樣品中的次黃岑素的含量。五倍子蜂蜜中次黃岑素的含量范圍是30～100 μg/kg，而百花蜜中次黃岑素的含量低于5 μg/kg。我們認(rèn)為可將次黃岑素作為延安地區(qū)五倍子蜂蜜的特征物用于其質(zhì)量控制。

圖2 次黃岑素的串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖

3 結(jié)論

為了篩選鑒別延安地區(qū)五倍子蜂蜜的特征酚類化合物，我們首先分析了延安地區(qū)五倍子蜂蜜和多花蜂蜜中的酚類化合物，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法篩選出次黃岑素可作為延安五倍子蜂蜜的特征酚類化合物，進(jìn)一步建立了UHPLC-MS/MS方法對(duì)蜂蜜中的次黃岑素進(jìn)行準(zhǔn)確定量，其在五倍子蜂蜜中的含量為30～100 μg/kg，而百花蜜中的含量低于5 μg/kg。綜上，次黃岑素可作為特征組分對(duì)延安地區(qū)的五倍子蜂蜜進(jìn)行質(zhì)量控制。