三七種植土壤中對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的化感作用

趙 靜,萬瓊蓮,焦 蓉,王占娣,王連春

(玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 紅塔 653100)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Bruk)F.H.Chen]是五加科人參屬植物，分布于中國云南省東南部，生于海拔1200～1800 m地帶，廣西省西南部亦有栽培。三七性喜溫暖陰濕，其獨特的生長環(huán)境易誘發(fā)多種病害，隨著其種植面積的不斷擴(kuò)大及連作障礙的制約，三七種植中病蟲害問題成為制約三七生產(chǎn)的重要因子，隨著種植時間的延長，發(fā)病程度日益嚴(yán)重。三七病害的發(fā)生是三七—土壤—土壤生物整個生態(tài)系統(tǒng)綜合作用的結(jié)果，查明三七根系分泌物對土壤微生物化感效應(yīng)的影響，是減輕或解決三七種植中病害發(fā)生的關(guān)鍵問題。【前人研究進(jìn)展】隨著連作年限的延長，根腐病發(fā)病率增加最為明顯[1]。引起三七根腐病的病原有真菌性病原也有細(xì)菌性病原，其中以鐮刀菌型根腐病最為多見。因此，鐮刀菌屬真菌為三七根腐病的主要病原菌。阮興業(yè)等[2]認(rèn)為，三七根腐病的主要病原菌為腐皮鐮刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]。王拱辰等[3]研究認(rèn)為，三七根腐病除腐皮鐮刀菌外，還有尖孢鐮刀菌(F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)和串珠鐮孢中間變種(F.monilliformevar.intermedium Neish & M.Legg)。其中，以尖孢鐮刀菌(F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)最為多見。根腐病的發(fā)生與連作條件下植物根系分泌物對病原菌的化感作用有密切關(guān)系。Shahzad等[4]指出，根系分泌物是植物促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)礦化的主要途徑。植物通過其分泌物不僅為土壤微生物提供能量，而且似乎同時控制著能量的使用方式。對羥基苯甲酸為酚酸類化感物質(zhì)，是自然界中常見的化合物，存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。酚酸類物質(zhì)是產(chǎn)生作物連作障礙的主要因素，它可以直接或間接的促進(jìn)或抑制微生物群落，進(jìn)而影響作物生長?！颈狙芯壳腥朦c】實驗室前期研究結(jié)果表明，對羥基苯甲酸為三七重茬土壤中含量較高的三七根系分泌物，實驗室條件下，對羥基苯甲酸濃度為5.0 mmol/L時最有利于尖孢鐮刀菌生長[5]。但該濃度與自然生理狀態(tài)下土壤中的濃度是否相符？對羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌之間的相關(guān)性如何？目前尚未見系列報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采集了三七道地產(chǎn)區(qū)云南省文山州種植地區(qū)不同種植年限的三七根系土壤，采用HPLC技術(shù)、宏基因組學(xué)技術(shù)，結(jié)合酶學(xué)研究方法，分析對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的化感作用，從而為由尖孢鐮刀菌引起的三七根腐病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤的采集 土樣采集于三七道地產(chǎn)區(qū)云南省文山州的硯山地區(qū)，位于云南省東南部、文山州中西部(23°23′N，103°30′E)。選取三七種植年限分別為1年(處理T1)、2年(處理T2)、3年(處理T3)的地塊，利用五點取樣法，在每塊種植田4個角落及中心點選取共計5個采樣點，采集三七根系周圍5 cm范圍內(nèi)土壤，分別以1年生[處理T1(CK)]、2年生[處理T2(CK)]、3年生[處理T3(CK)]種植地塊周圍未種植過三七的土壤為對照。

1.1.2 病原菌菌株 尖孢鐮刀菌為玉溪師范學(xué)院滇中道地藥材研究重點實驗室分離，并通過接種實驗、生理生化性狀及分子生物學(xué)鑒定確定的尖孢鐮刀菌三七?；途?F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)。

1.2 土壤中對羥基苯甲酸含量測定

1.2.1 土壤中對羥基苯甲酸粗提液的制備 將采集的土壤過24目篩，除去樣品中三七根須、殘枝落葉等雜物。取土10 g用氫氧化鈉1 mol/L溶解，超聲震蕩30 min后靜置24 h，離心機(jī)離心20 min(8000 r/min)。取上清液，用HCl 12 mol/L調(diào)節(jié)pH 2.5，超聲震蕩10 min，靜置2 h后，用離心機(jī)離心10 min(8000 r/min)，取上清液，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，每次30 min，保留乙酸乙酯。最后將3次所得乙酸乙酯混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃蒸干，剩余最后1～2 mL時，停止蒸發(fā)，用80%甲醇2 mL 溶解，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測試。

1.2.2 HPLC儀器條件 色譜條件：spursil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；上樣量：20 μL；流動相：磷酸二氫鉀25 mmol，調(diào)節(jié)pH 2.5；檢測波長，210 nm。

1.3 土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的分析

土壤總DNA的提取參照趙靜等[6]的方法進(jìn)行。利用通用引物擴(kuò)增真菌NS1-FUNG通用引物標(biāo)簽序列，序列擴(kuò)增、純化、均一化參照Rodrigues等[7]的方法。土壤真菌宏基因組序列的測定及數(shù)據(jù)的分析，參照趙靜等[6]的方法進(jìn)行。

1.4 對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌的生長及酶活性分析

1.4.1 菌株的處理 將活化后的尖孢鐮刀菌菌株分別接種于含有1.0(處理1)、2.5(處理2)、5.0(處理3)、7.5(處理4)、10.0(處理5)、50.0(處理6)mmol/L的對羥基苯甲酸PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃下培養(yǎng)，以不添加對羥基苯甲酸的PDA培養(yǎng)基為對照[處理0(CK)]。

1.4.2 菌落生長情況測定 將上述菌株分別培養(yǎng)24、48、72 h觀察菌落的生長情況，采用直尺測定菌落直徑(cm)，并觀察菌落的顏色及菌絲的致密度。

1.4.3 產(chǎn)孢量的測定 采用血球計數(shù)平板法，滅菌的純凈水2 mL沖洗培養(yǎng)72 h后的真菌平板，收集液用純水定容至2 mL。取上述孢子懸浮液100 μL，利用血球計數(shù)器計數(shù)，并按照下式計算平板上孢子總數(shù)。

孢子總數(shù)=A/5×16×B×104

式中，A為血球計數(shù)器方格中的總菌數(shù)；B為稀釋倍數(shù)20。

1.4.4 酶活性分析 水解酶(果膠酶、纖維素酶)的測定，參照Wu等[8-10]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七不同種植年限土壤中對羥基苯甲酸含量測定

由表1可見，處理T1(CK)、T2(CK)、T3(CK)的對羥基苯含量分別為3.48、3.95、2.22 mmol/L，這可能是由于取樣地雖處于同一個地理區(qū)域，但不同地塊土壤性狀不同導(dǎo)致土壤中對羥基苯甲酸含量不一致。1年生三七土壤(處理T1)中對羥基苯甲酸含量最高，達(dá)到5.11 mmol/L，比同一地塊未種植過三七的土壤高1.6倍；2年生三七土壤(處理T2)中對羥基苯甲酸含量為3.95 mmol/L，比同一地塊未種植過三七的土壤高1.5倍；3年生三七土壤(處理T3)中對羥基苯甲酸含量最低，為2.22 mmol/L，比同一地塊未種植過三七的土壤低。從各種植年限土壤樣品中對羥基苯甲酸含量與對照樣品差異值可看出，隨著種植年限的延長，三七根系周圍土壤中對羥基苯甲酸增加量呈下降趨勢，即種植三七第1年土壤中對羥基苯甲酸含量增加最為顯著，第2年降低，第3年下降最為明顯，低于對照2.1倍。

表1 三七不同種植年限土壤中對羥基苯甲酸含量及鐮刀菌種群密度

2.2 不同種植年限三七根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，不同種植年限的三七根際土壤中在屬水平上檢測出占比水平較高的11類真菌，分別是附球霉屬(Epicoccum)、擬層孔屬(Fomitopsis)、鐮刀菌屬(Fusarium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、輪枝菌屬(Verticillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、軟韌革菌屬(Chondrostereum)、盔孢傘屬(Galerina)、青霉屬(Penicillium)、黑蛋巢菌屬(Cyathus)、擬青霉屬(Paecilomyces)。三七種植前后各種植年限土壤樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組成及種群密度具有明顯不同：1年生土壤樣品中，未種植過三七的土壤中主要以附球霉屬(Epicoccum)為優(yōu)勢菌種(20.68%)，而種植三七后明顯下降(1.56%)，擬層孔屬(Fomitopsis)成為優(yōu)勢菌種(38.19%)；2年生土壤樣品中，未種植過三七的土壤中主要以附球霉屬(Epicoccum)、擬層孔屬(Fusarium)為優(yōu)勢菌種，占比分別為22.72%、19.97%，而種植三七后2種真菌種群密度均明顯下降，占比分別為9.17%、7.99%；3年生土壤樣品中，未種植過三七的土壤中主要以Pottia為優(yōu)勢菌種(43.02%)，而種植三七后明顯下降(0.69%)，擬層孔屬(Fusarium)成為優(yōu)勢菌種(20.94%)，擬層孔屬(Fusarium)取代Pottia成為優(yōu)勢菌種，其占比由2.98%上升到20.94%，增加了10倍，該屬真菌主要引起三七根腐病。

圖1 不同三七種植年限土壤中真菌群落組成結(jié)構(gòu)特征

結(jié)合土壤中對羥基苯甲酸含量的分析可知，當(dāng)土壤中對羥基苯甲酸含量為2.61 mmol/L時，土壤中鐮刀菌種群密度最高，為20.94%。隨著對羥基苯甲酸含量的增加，土壤中鐮刀菌種群密度下降，當(dāng)其含量為5.11 mmol/L時，鐮刀菌種群密度僅為1.057%。但值得注意的是，土壤中對羥基苯甲酸含量并不是越低越有利于鐮刀菌的生長，當(dāng)土壤中對羥基苯甲酸含量為2.00～3.00 mmol/L，對羥基苯甲酸含量高，鐮刀菌種群密度也高。3年生土壤樣品中，對羥基苯甲酸含量為2.22 mmol/L，鐮刀菌種群密度為19.07%；而2年生對照土壤樣品中，對羥基苯甲酸含量為2.61 mmol/L，鐮刀菌種群密度為20.94%。

2.3 對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌孢子及菌落生長分析

由表2可見，與不添加對羥基苯甲酸的處理0(CK)相比，不同濃度的對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌化感作用不同，主要表現(xiàn)為高濃度(7.5～50.0 mmol/L)抑制，其菌落直徑與對照相比降低，菌絲生長較為致密；中濃度(2.5～5.0 mmol/L)促進(jìn)生長，其菌落直徑與對照相比升高，菌落顏色在培養(yǎng)24 h既呈現(xiàn)紫色，菌絲生長較對照稍綿密，顯微鏡下可觀察到大量分生小孢子的生成；低濃度(1.0 mmol/L)與處理0(CK)相比，并未顯示出明顯區(qū)別。

表2 對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌生物量

2.4 對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌酶活性分析

在2.5～10.0 mmol/L濃度的對羥基苯甲酸處理下，促進(jìn)了尖孢鐮刀菌果膠酶的活性，其中濃度為2.5 mmol/L時，果膠酶活力為1.02 U/(mL·min)。而高濃度的對羥基苯甲酸(50.0 mmol/L)則對纖維素酶活力的刺激作用更為明顯，達(dá)到最高值1.84 μmol/min。在2.5～10.0 mmol/L濃度的對羥基苯甲酸脅迫下，纖維素酶活力變化不大(圖2～3)。

圖2 對羥基苯甲酸脅迫下果膠酶活力

3 討 論

3.1 對羥基苯甲酸化感促進(jìn)尖孢鐮刀菌最佳濃度效應(yīng)值分析

植物根系是植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分的重要組織，在植物的生長過程中，根系也向根際土壤周圍釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物，這些物質(zhì)是一類復(fù)雜的混合物，是植物連作對根際土壤微生物產(chǎn)生影響的重要媒介之一，參與植物與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換與信號傳遞，是根際最為重要的營養(yǎng)和能量來源，也是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素，這些物質(zhì)可能成為微生物的營養(yǎng)碳源、氮源或信號刺激物[11-12]。本研究中，三七種植根系土壤中對羥基苯甲酸含量并未隨著三七種植年限的延長而增加，反而逐年降低。這可能是由于其刺激了土壤真菌的生長，作為營養(yǎng)物質(zhì)在真菌的增殖和孢子的萌發(fā)過程中被消耗，導(dǎo)致其濃度降低。據(jù)文獻(xiàn)報道，阿魏酸是地黃根系的主要分泌物，為根際尖孢鐮刀菌提供碳源[13]，使病原菌獲得充足的繁殖養(yǎng)分，從而使得病原菌數(shù)量不斷增加，有益的拮抗菌數(shù)量減少。而土壤中對羥基苯甲酸含量的逐年降低恰恰更有利于尖孢鐮刀菌的生長，這與舒陽[14]及本研究前期研究結(jié)果相似，鐮刀菌屬真菌是三七種植后，土壤中分離最多的真菌屬。本研究中，當(dāng)對羥基苯甲酸含量為2.61 mmol/L時，土壤中尖孢鐮刀菌的種群密度最高。

圖3 對羥基苯甲酸脅迫下纖維素酶活力

而實驗室條件下，2.5～5.0 mmol/L的對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的化感促進(jìn)作用最強(qiáng)。該濃度下，尖孢鐮刀菌菌落直徑最大，產(chǎn)孢量明顯增加，且可促進(jìn)分生大孢子的產(chǎn)生。然而土壤中的對羥基苯甲酸濃度達(dá)到3.95 mmol/L時，根系土壤中尖孢鐮刀菌含量僅為7.99%，隨著對羥基苯甲酸濃度的升高，病原菌種群密度也降低。對羥基苯甲酸濃度為2.5 mmol/L時，鏡檢可發(fā)現(xiàn)大量分生大孢子產(chǎn)生。已有研究表明，尖孢鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上一般以產(chǎn)生分生小孢子為主，分生大孢子不與分生小孢子混生[15]。本研究中，不添加對羥基苯甲酸的處理鏡檢僅見分生小孢子，這說明對羥基苯甲酸可促進(jìn)尖孢鐮刀菌分生大孢子的產(chǎn)生。因此，本研究中對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的最佳濃度效應(yīng)值范圍應(yīng)結(jié)合土壤含量及實驗室條件下的濃度值確定為2.0～3.0 mmol/L。

3.2 對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌致病性的影響

酚酸類物質(zhì)對病原真菌的化感作用除了誘導(dǎo)增殖外，還可以促進(jìn)次生代謝物包括毒素、細(xì)胞壁降解酶類等的分泌[16]。β-1,3葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶活性影響尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的致病能力[17-19]。果膠酶作為鐮刀菌主要的致病性因素，其活性的大小直接關(guān)系到植物的發(fā)病程度,而纖維素酶活力也影響鐮刀菌的致病力[16]。除了這3種細(xì)胞壁降解酶外，尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)中還含有編碼內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶、外切半乳糖醛酸酶、果膠酸內(nèi)裂解酶以及木聚糖酶基因存在，Jonkers等[20]發(fā)現(xiàn)，利用基因敲除技術(shù)敲除其中任何一個編碼此類蛋白的基因，都會導(dǎo)致尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)對寄主致病性全部或部分喪失。本研究中，中等濃度(2.5～10.0 mmol/L)的對羥基苯甲酸脅迫下可刺激果膠酶的分泌。而纖維素酶在高濃度(50 mmol/L)的對羥基苯甲酸條件下活性更強(qiáng)。果膠酶、纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶其分泌量受到微生物碳源、氮源的影響。對羥基苯甲酸在培養(yǎng)基中的添加，增加了碳源，促進(jìn)了果膠酶、纖維素酶的分泌，結(jié)果顯示高濃度對羥基苯甲酸促進(jìn)了果膠酶、纖維素酶活性，這與袁婷婷等[21]的研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

三七自然生長狀態(tài)下，土壤中對羥基苯甲酸在2.0～3.0 mmo/L含量下對尖孢鐮刀菌種群具有較強(qiáng)的化感促進(jìn)作用。表現(xiàn)為可促進(jìn)尖孢鐮刀菌生物量的增長及孢子的增殖，促進(jìn)致病性酶活性增加。