廣西樂業(yè)野生春蘭iPBS遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建

曾艷華，何荊洲，龍薔宇，范繼征，李秀玲，卜朝陽

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，南寧 530007)

【研究意義】春蘭(Cymbidiumgoeringii)是我國傳統(tǒng)蘭花中栽培歷史最悠久、分布最廣泛的一個種，具有較高的觀賞價(jià)值，廣西各地山區(qū)均有分布。廣西樂業(yè)縣位于桂西北，地處云貴高原東南麓，年均氣溫16.3 ℃，屬亞熱帶濕潤氣候區(qū)，特別適合蘭科植物生長，被稱為中國野生蘭花之鄉(xiāng)，目前已發(fā)現(xiàn)有蘭科植物52屬156種[1]，其中蘭屬植物16種，以春蘭品種數(shù)量居多。春蘭多為異花授粉，頻繁的種間雜交產(chǎn)生了廣泛的遺傳變異。與其他蘭科植物相比，春蘭在葉形、葉色、花形、花香和花色上具有更豐富的遺傳多樣性及良好的個體選擇機(jī)會，但也給其種質(zhì)分類、鑒定和育種工作帶來困難。引物結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增(iPBS)是以長末端重復(fù)序列(LTRs)類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[2]，與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)相比，其操作簡單有效，無需預(yù)先獲知相關(guān)的LTR序列，在品種鑒別和遺傳多樣性分析方面更具優(yōu)勢。目前，該技術(shù)在國內(nèi)外已成功應(yīng)用于石斛蘭[3]、金花茶[4]、枸杞[5]、葡萄[6-8]、牡丹[9]、番石榴[10]等多種園藝植物及農(nóng)作物[11-13]的種質(zhì)分類、遺傳分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建。因此，應(yīng)用iPBS分子標(biāo)記分析春蘭種質(zhì)的遺傳多樣性并構(gòu)建DNA指紋圖譜，對廣西地區(qū)春蘭種質(zhì)的分類、保護(hù)及利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】分子標(biāo)記是進(jìn)行物種遺傳研究的有力工具，在種質(zhì)資源鑒定評價(jià)和遺傳育種中發(fā)揮著重要作用，已廣泛應(yīng)用于蘭屬植物種質(zhì)資源研究[14]。近年來，應(yīng)用于春蘭野生資源和栽培品種遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記有ISSR、SRAP、RAPD、AFLP和ITS，其中以ISSR和SSR分子標(biāo)記應(yīng)用最多。已有研究表明，利用SSR分子標(biāo)記可對不同地域春蘭資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[15-17]；Huang等[18]開發(fā)出15個春蘭的SSR分子標(biāo)記并成功應(yīng)用于春蘭遺傳研究；Lee等[19]研究表明，SSR分子標(biāo)記可對春蘭雜交后代進(jìn)行種間鑒定；彭德鎮(zhèn)[20]利用ISSR分子標(biāo)記分析了江西境內(nèi)350個野生春蘭的遺傳多樣性，以14條篩選出的引物對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到139條譜帶，其中多樣性條帶118條；高麗和楊波[21]利用ISSR分子標(biāo)記對湖北11個野生春蘭居群的遺傳多樣性水平進(jìn)行研究，11條引物共檢測到127個位點(diǎn)，其中112個為多態(tài)位點(diǎn)；孫葉等[22]利用ISSR分子標(biāo)記分析了96份中、日春蘭資源遺傳多樣性；謝慧敏等[23]利用ISSR分子標(biāo)記分析江西主要山脈21個春蘭野生居群的遺傳結(jié)構(gòu)與分化特征，并依據(jù)研究結(jié)果提出資源保護(hù)策略；Hui等[24]利用ISSR分子標(biāo)記分析春蘭栽培品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系。SRAP分子標(biāo)記在基因組中分布均勻，但易受反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化影響。牛田等[25]利用SRAP分子標(biāo)記對42個春蘭商品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出的15對引物組合共擴(kuò)增出185個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個，可較好地揭示供試材料的親緣關(guān)系。RAPD分子標(biāo)記因費(fèi)用低廉和易于分析，也發(fā)展成為傳統(tǒng)的DNA分析方法。季祥彪等[26]采用RAPD分子標(biāo)記分析貴州野生春蘭的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生春蘭具有豐富的遺傳變異，同時說明RAPD分子標(biāo)記可有效用于春蘭野生資源遺傳多樣性評價(jià)；孫彩云等[27]等利用RAPD分子標(biāo)記分析中國蘭屬的50個材料，結(jié)果表明春蘭品種的多樣性高于其他測試品種，即春蘭的遺傳多樣性整體水平較高；單麗麗等[28]進(jìn)行春蘭基因組DNA提取及對RAPD-PCR反應(yīng)體系中各影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合春蘭RAPD分子標(biāo)記的最佳反應(yīng)體系。AFLP也是一種檢測DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記，具有高分辯率、高重復(fù)性、高靈敏度和共顯性等特點(diǎn)。王曉英等[29]研究證實(shí)，AFLP分子標(biāo)記能有效分析春蘭商品種的遺傳多樣性；陳惠云等[30]利用AFLP分子標(biāo)記對18種主要名貴春蘭品種進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，篩選出16對引物，可明確將供試的18個名貴春蘭品種加以區(qū)分，為保護(hù)名貴春蘭育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒定和檢測品種真?zhèn)翁峁┘夹g(shù)依據(jù)。陳雯[31]基于ITS分子標(biāo)記分析江西11個野生春蘭居群100個春蘭種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)，揭示了不同地理區(qū)域春蘭的遺傳多樣性差異、遺傳分化、居群遺傳結(jié)構(gòu)和基因流特點(diǎn)。【本研究切入點(diǎn)】迄今，應(yīng)用iPBS分子標(biāo)記對野生春蘭種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以iPBS分子標(biāo)記對收集于廣西樂業(yè)縣的81份野生春蘭種質(zhì)和4份春蘭栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析評估，構(gòu)建野生春蘭DNA數(shù)字指紋圖譜，為野生春蘭種質(zhì)資源的分類和早期鑒定評價(jià)、種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試春蘭種質(zhì)共85份(表1)，其中，81份野生春蘭種質(zhì)收集于廣西樂業(yè)縣，保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭花種質(zhì)資源圃；以4份春蘭傳統(tǒng)商品種(國蘭傳統(tǒng)名品栽培品種)為對照，分別為余蝴蝶(C.goeringii‘Yu Hu Die’)、宋梅(C.goeringii‘Song Mei’)、笑蝶(C.goeringii‘Xiao Die’)和環(huán)球荷鼎(C.goeringii‘Huan Qiu He Din’)，均采集于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭花種質(zhì)資源圃。取樣時選取每份種質(zhì)3株植株的健康嫩葉，分別用自封袋裝好，冰盒包裝送至實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 85份春蘭種質(zhì)的名稱和來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2015—2019年在廣西樂業(yè)縣陸續(xù)收集供試材料，栽培于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭花種質(zhì)資源圃，2021年3月選取各性狀趨于穩(wěn)定的每份種質(zhì)3株，每株采集2枚健康幼葉，分別用封閉的塑料袋包裝，保存于冰盒，及時送回實(shí)驗(yàn)室液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA提取 春蘭基因組DNA采用Easy Pure Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)試劑盒提取，每個樣本選取3株植株的葉片等量混合，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，采用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，將提取的DNA以TE緩沖液稀釋至20.0 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選及iPBS-PCR擴(kuò)增 采用Kalendar等[2]發(fā)表的83個iPBS引物序列對供試材料DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。從合成的引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物對供試樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 10.0 μL，模板DNA 1.0 μL，引物1.0 μL，無菌水8.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃(不同引物退火溫度見表2)45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存，取10.0 μL 用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，同一遷移位置上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。以記錄的擴(kuò)增引物條帶構(gòu)建“0，1”矩陣，以NTSYS-pc 2.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類并構(gòu)建樹狀圖。利用POPGEN 1.32計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)和Shannon信息多樣性指數(shù)(I)。根據(jù)聚類分析結(jié)果，篩選出可鑒別供試材料的引物，根據(jù)引物組合的“0，1”矩陣，構(gòu)建野生春蘭的DNA數(shù)字指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 iPBS引物篩選與種質(zhì)遺傳多態(tài)性分析

利用83個iPBS引物序列對85份春蘭種質(zhì)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，篩選出6條多態(tài)性好、重復(fù)性高、條帶清晰的引物(分別為2081、2076、2225、2251、2249和2232)。由表2可知，6條引物共擴(kuò)增條帶數(shù)105條，平均每條引物擴(kuò)增條帶17.5條。其中，多態(tài)性條帶95條，多態(tài)性比率達(dá)90.48%；以引物2249的擴(kuò)增效果最好，擴(kuò)增的條帶數(shù)最多(20條)，多態(tài)性位點(diǎn)比率(PPL)達(dá)100.00%。圖1為引物2249對樣本編號1～40春蘭種質(zhì)的擴(kuò)增圖譜。

M為標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～40為春蘭種質(zhì)編號(與表1相同)。

表2 6條引物對85份春蘭種質(zhì)的PCR擴(kuò)增結(jié)果及85份春蘭資源的遺傳多樣性指數(shù)

各引物的多態(tài)性信息含量(PIC)變輻很小，為0.8022～0.8152，平均為0.8050，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0051，說明6條引物在85份春蘭種質(zhì)間均具有較高的多態(tài)性；平均Na為1.7923，Ne最高為1.4991，平均為1.2204；平均Nei’s和I分別為0.2765和0.4590，其中，引物2249擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)I最高，達(dá)0.8022；各遺傳多樣性指數(shù)均較高，標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，說明供試春蘭種質(zhì)間遺傳多樣性豐富。

2.2 春蘭種質(zhì)資源間的遺傳相似性分析

采用“0,1”矩陣對擴(kuò)增條帶進(jìn)行遺傳相似性分析，得到85份春蘭種質(zhì)資源兩兩間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.690～0.981，平均為0.744，供試野生春蘭資源在iPBS分子標(biāo)記的水平上變幅不明顯。其中，編號為75號(C19138-25)與74號(C19138-24)的遺傳相似系數(shù)最大，其次是56號(C19138-16)與57號(C19138-17)及64號(C19138-32)與70號(C19138-23)，其遺傳相似系數(shù)均為0.971。說明這些春蘭種質(zhì)的親緣關(guān)系非常接近，可認(rèn)定為同一品種或相似品種；親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的是編號為21號(C18027-1)與58號(C19138-1)、35號宋梅與58號(C19138-1)、35號宋梅與54號(C19138-5)，其次是16號(C18019-12)與59號(C19138-3)、16號(C18019-12)與60號(C19138-2)、21號(C18027-1)與63號(C19138-19)、35號宋梅與48號(C19138-37)、44號(C18036-4)與85號(C19138-38)及76號(C19138-33)與85號(C19138-38)，這6組春蘭種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)均為0.690。

2.3 春蘭種質(zhì)資源的聚類分析

從圖2可看出，在遺傳相似系數(shù)為0.704處，可將85份春蘭種質(zhì)區(qū)分為4個類群。其中，第Ⅰ類群包含79份種質(zhì)，第Ⅱ類群包含4個春蘭商品種(編號為34、35、51和50)，第Ⅲ和第Ⅳ類群均只有1份種質(zhì)，分別是21號和36號；4個春蘭栽培品種均聚在一起，與其他春蘭種質(zhì)遺傳距離相對較遠(yuǎn)；遺傳相似系數(shù)較大的75號與74號、56號與57號及64號與70號均聚在一起，而遺傳相似系數(shù)較小的幾組種質(zhì)均聚到不同的組；除21號和36號種質(zhì)外，其他廣西樂業(yè)縣野生春蘭種質(zhì)均來源于同一分支，說明21號和36號種質(zhì)的親緣關(guān)系與其他廣西樂業(yè)縣野生春蘭種質(zhì)相對較遠(yuǎn)，需進(jìn)一步探究其遺傳分化原因。

2.4 春蘭種質(zhì)資源數(shù)字指紋圖譜構(gòu)建

以6條引物對85份春蘭種質(zhì)擴(kuò)增的條帶圖譜進(jìn)行記錄，由此構(gòu)建廣西樂業(yè)縣85份春蘭種質(zhì)“0，1”數(shù)字指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物2249擴(kuò)增的PPL最高，達(dá)100.00%，可區(qū)分67份種質(zhì)；引物2081擴(kuò)增的PPL為82.35%，可區(qū)分41份種質(zhì)。說明利用引物2249和2076組合可將85份春蘭種質(zhì)資源全部區(qū)分出來(表3)。

表3 引物2249和2076構(gòu)建的85份春蘭種質(zhì)資源DNA指紋圖譜

3 討 論

種質(zhì)資源評價(jià)是資源在作物改良中得以利用的前提條件，通過分子標(biāo)記輔助確定種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)，鑒定、管理與重要農(nóng)藝性狀有關(guān)的等位基因和種質(zhì)，可彌補(bǔ)表型評價(jià)的不足。隨著新一代大規(guī)模測序技術(shù)的迅速發(fā)展，我國蘭花的基因組研究取得了突破性進(jìn)展，完成了多種蘭屬植物[32-33]的高質(zhì)量參考基因組測序和組裝，為今后功能基因的挖掘與利用打下了基礎(chǔ)。植物遺傳多樣性研究與種質(zhì)資源收集、保存和更新密切關(guān)聯(lián)，是種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的基礎(chǔ)。通過遺傳多樣性分析，可檢測種質(zhì)的遺傳變異程度和遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而評價(jià)種質(zhì)資源的遺傳潛力，對種質(zhì)資源遺傳完整性的保存、核心種質(zhì)篩選及種質(zhì)資源分類等具有重要參考價(jià)值[34]，張德全和楊永平[35]對不同類型植物的遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示單子葉植物的I為0.2570，按照生活型劃分，草本植物的I為0.2380，按照繁育系統(tǒng)劃分，蟲媒植物的I為0.2620；高麗和楊波[21]、謝慧敏等[22]研究表明，利用ISSR分子標(biāo)記分析江西野生春蘭和湖北野生春蘭的I分別為0.3613和0.4037。本研究中，廣西樂業(yè)縣85份春蘭種質(zhì)的I平均值為0.4590，遺傳多樣性處于較高水平，與蘭科中親緣關(guān)系較近的建蘭[36]、墨蘭[37]和寒蘭[38]相比，其多樣性水平仍屬最高，說明廣西樂業(yè)縣的生境非常復(fù)雜。此外，春蘭為多年生草本植物，是蘭屬的廣布種，這也是春蘭物種多樣性水平較高的主要原因之一，同時說明iPBS分子標(biāo)記可成功運(yùn)用于春蘭種質(zhì)資源鑒別及遺傳多樣性分析，能檢測到較ISSR分子標(biāo)記更高的遺傳多態(tài)。

iPBS分子標(biāo)記的每一引物組合檢出的多態(tài)性條帶數(shù)量多、重復(fù)性好，適用于不同種質(zhì)間的遺傳關(guān)系研究和系譜分析。已有研究證實(shí)，利用iPBS分子標(biāo)記分析物種的親緣關(guān)系時，基本都能按地域分布聚類[5-6，39]。本研究結(jié)果表明，來源于同一產(chǎn)地的春蘭栽培品種均聚在一起，反映出春蘭栽培品種與野生種質(zhì)的遺傳差異較大，而4個栽培品種間的遺傳差異較小，是長期人為定向選擇的結(jié)果[40]；81份野生春蘭種質(zhì)中有79份具有相同起源，說明廣西樂業(yè)縣不同居群的春蘭間變異不明顯，總體遺傳分化程度很小，其中遺傳相似系數(shù)較大的種質(zhì)均聚在一起；兩兩之間遺傳相似系數(shù)最大的種質(zhì)為C19138-25與C19138-24、C19138-16與C19138-17及C19138-32與C19138-23，結(jié)合其表型性狀來看，兩兩之間的花色花形非常相似，可判定為近似品種；種質(zhì)C18027-1和C18036-30的遺傳距離與廣西樂業(yè)種質(zhì)較遠(yuǎn)，從花的表型性狀來看，C18027-1有卷曲的側(cè)萼片，C18036-30的花瓣質(zhì)地較厚，花梗更高，花形較獨(dú)特，可能是由于變異導(dǎo)致遺傳分化，但具體原因需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié) 論

iPBS分子標(biāo)記可用于春蘭種質(zhì)的有效鑒別和遺傳多態(tài)性分析。81份廣西樂業(yè)野生春蘭種質(zhì)表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，兩兩間的遺傳相似系數(shù)變幅不明顯，基因交流較頻繁，遺傳背景較相似；4個春蘭栽培品種與81份野生春蘭種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)較小，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，從分子水平上驗(yàn)證了產(chǎn)于廣西樂業(yè)的野生春蘭與栽培品種在遺傳背景上存在差異。