基于ITS 和形態(tài)學系統(tǒng)分析新疆樺木屬種間系統(tǒng)發(fā)育關系

楊梅花 苗江林 厚富霞 王蕾蕾 程錦濤

（石河子大學農學院，新疆 石河子 832000）

樺木屬（Betula）是樺木科（Betulaceae）中分布在新疆的唯一屬，我國有31 種及若干變種。新疆是我國西北地區(qū)樺木屬植被地理分化中心[1]，《新疆植物志》[2]中記載有8 個種，其中鹽樺（Betula halophila）被列為瀕危物種[3]。樺木屬植物是組成溫帶和暖溫帶森林群落的優(yōu)勢樹種[1]，具有重要的生態(tài)價值和經濟價值。

核基因內部轉錄間隔區(qū)（ITS）是植物基因中進化較快的DNA 片段。ITS 序列能提供豐富的信息位點。隨著分子技術快速發(fā)展，ITS 序列成為重要分子標記，被應用于屬及種間分類和系統(tǒng)發(fā)育研究[4-6]。國內對于樺木屬植物分類和系統(tǒng)發(fā)育研究，區(qū)域性明顯。陳之端[7]從古植物學和地理分布等角度對樺木科植物的起源和演化進行研究；黃金祥等[8]對河北境內樺木屬植物進行了形態(tài)分類與地理分布的研究；劉果厚[9]和侯安燕[10]從植物形態(tài)部位對內蒙古和北京地區(qū)的樺木屬植物分類進行研究；姜靜等[11]利用RAPD 標記技術對東北地區(qū)樺樹種間親緣關系進行分析；梅新娣等[12]應用ITS 序列對鹽樺進行了系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

目前，從系統(tǒng)分類學對新疆樺木屬資源進行研究報道很少。本研究選取新疆樺木屬中天山樺（Betula tianschanica）、小葉樺（Betula microphylla）、白 樺（Betula platyphylla）、垂 枝 樺（Betula pendula）、甸生樺（Betula humilis）與鹽樺6 種代表植物，以巖樺（Betula calcicola）、高山樺（Betula delavayi）、矮樺（Betula potaninii）和賽黑樺（Betula schmidtii）作為外類群，從分子生物學和形態(tài)學角度綜合評價新疆樺木屬植物的系統(tǒng)分類關系，以期為樺木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇新疆樺木屬6 個種，其他樺木屬10 個種，涵蓋《中國植物志》[13]記載的中國境內樺木屬2 組及5 亞組植物。16 種樺木屬植物ITS序列來自美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫，種名、組/亞組及ITS 序列信息見表1。

表1 樺木屬16 種植物ITS 序列信息Table 1 ITS sequences of genus from 16 Betula

1.2 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

運用Clustal Omega 軟件對樺木屬16 種植物ITS 序列進行對比分析，空位被處理為缺失。然后使用MEGA 7.0 軟件進行自展分析重復1 000 次，評估簡約樹中各分支的自展支持率，計算亞組及種間遺傳距離，構建最大似然法（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.3 形態(tài)性狀的選取及編碼

參考《中國植物志》及《新疆植物志》等書籍資料中有關樺木屬植物形態(tài)性狀的記載，選取種間差異大的形態(tài)性狀，經過SPSS 25.0 軟件KMO 檢驗和Bartlett 球度檢驗[15]，最終選取7 個表型性狀作為指標進行聚類分析（表2）。為準確反映出各性狀之間的差異程度，采用邏輯順序賦值量化，確定形態(tài)學性狀的分析數據。在此基礎上，運用SPSS 對統(tǒng)計數據進行主成分及系統(tǒng)聚類分析[16]，采用沃德聯(lián)接法構建形態(tài)聚類譜系圖。

表2 性狀及編碼Table 2 Traits and coding

2 結果與分析

2.1 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究結果顯示，樺木屬16 種植物的ITS 序列長度范圍為604～612 bp，當空位作為缺失處理時，排序后的長度為612 bp。序列位點比對顯示共有46 個變異位點，占序列總長的7.52%，其中26 個為簡約信息位點。由表3 可知，樺木亞組（Subsect. Betula）與柴樺亞組（Subsect. Fruticosae）、黑樺亞組（Subsect. Dahuricae）之間遺傳距離較小，均為0.004 7。碩樺亞組（Subsect. Costatae）內絕對遺傳距離較小，為0.003 3。新疆樺木屬所在的樺木亞組和柴樺亞組遺傳距離較近為0.004 7，樺木亞組內部絕對遺傳距離為0.006 0。

表3 樺木屬內各亞組間與各亞組內遺傳距離Table 3 Genetic distance between and within each subgroup of Betula

由圖1 可知，16 種樺木屬植物被分為四大支。首先外類群堅樺亞組的巖樺、矮樺、高山樺和賽黑樺聚為F 分支，西樺組的長穗樺（Betula cylindrostachya）、亮葉樺（Betula luminifera）和西樺（Betula alnoides）與碩樺亞組的糙皮樺（Betula utilis）和紅樺（Betula albosinensis）各自聚為E 和D 分支。在樺木屬ML 系統(tǒng)發(fā)育樹中，西樺組E 分支支持率達到78%，組內種間序列的自相似度高。新疆樺木屬所在的樺木亞組C 分支和柴樺亞組B 分支交錯分布，同時該大支中包含有黑樺亞組的黑樺（Betula dahurica）。在樺木亞組分支中，小葉樺與鹽樺距離較遠，與天山樺距離相對較近。

由圖2 可知，新疆樺木屬6 種植物中，天山樺與小葉樺、白樺與垂枝樺各自聚集在一小支，遺傳距離分別為0.005 0 和0.001 7。甸生樺與鹽樺單獨聚為一支，遺傳距離為0.003 3。

圖1 基于ITS 序列分析構建16 種樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic trees of 16 Betula based on ITS sequence analysis

圖2 基于ITS 序列分析構建新疆樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Betula in Xinjiang based on ITS sequence analysis

2.2 主成分分析及聚類分析

2.2.1 主成分分析

運用SPSS 軟件對樺木屬16 種植物的7 個形態(tài)性狀編碼進行特征值和方差百分率計算，以特征值大于1 為準則提取主成分。由表4 可知，前3 個主成分累計貢獻率達84.5%，第1、2、3 主成分構成比例分別為48.7%、20.5%和15.3%。第1 主成分的特征值為3.407，特征向量中載荷最高且符號為正的性狀有生活型和樹皮剝裂及紋路，其特征向量為0.816 和0.889。第2 主成分特征值為1.437，從載荷值的大小看，第2 主成分反映葉片形狀。第3 主成分特征值為1.071，載荷值最高且符號為正的性狀主要是果苞背部被毛，特征向量為0.837。從3 個主成分的特征向量和貢獻率分析，生活型、樹皮剝裂及紋路是樺木屬分類較為重要的性狀。

表4 樺木屬植物主要性狀主成分分析Table 4 Principal component analysis of main characters of Betula

2.2.2 聚類分析

如圖3 所示，16 種樺木屬植物的形態(tài)性狀聚類所呈現(xiàn)結果與經典形態(tài)分類學擬合度較高。歐氏距離為5 時，長穗樺、亮葉樺和西樺聚為一類，均屬西樺組。歐氏距離為4.5 時，外類群堅樺亞組4 個種聚為一支。歐氏距離為3 時，新疆樺木屬6 種植物中，樺木亞組的鹽樺和柴樺亞組的甸生樺聚為混合類群，而天山樺、小葉樺、垂枝樺和白樺另聚為一個類群。相類似的黑樺亞組的黑樺和碩樺亞組的糙皮樺與紅樺聚為一個混合類群?？梢?，本研究中主成分分析貢獻率較高的性狀能反映形態(tài)分類的主要特點，說明主成分提取方法可行，結果可信。

圖3 16 種樺木屬植物形態(tài)性狀聚類圖Fig. 3 Cluster analysis of 16 Betula

由圖4 可知，歐氏距離為5 時，新疆樺木屬植物被聚為兩大支，分別為單支和混合支。歐氏距離為3 時，柴樺亞組的甸生樺與樺木亞組的鹽樺聚為一個混合支，處在樹狀圖的基部位置。另一大支中，樺木亞組的天山樺和小葉樺與垂枝樺和白樺各聚為一單支。總體而言，新疆樺木屬的形態(tài)性狀聚類結果與經典形態(tài)分類學中的《新疆植物志》分類結果擬合性較高。

圖4 新疆樺木屬植物形態(tài)性狀聚類圖Fig. 4 Cluster analysis of Betula in Xinjiang

3 結論與討論

3.1 新疆樺木屬進化關系

在分子系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)學聚類結果中，新疆樺木屬中天山樺和小葉樺均聚集在一起。地理分布上，小葉樺主要分布在阿爾泰山一帶，而天山樺則主要分布在天山山脈[17]，但兩物種的分布海拔范圍重疊程度較高。結合生長環(huán)境來看，小葉樺和天山樺都同屬于山地森林樹種，且從外部形態(tài)上均為高大喬木，有著很多共同的特征，如小堅果卵形、樹皮灰色，葉菱形等。ITS 分子水平兩者的遺傳距離為0.005 0，同質性比較高。這一研究結果顯示，小葉樺與天山樺在形態(tài)學與分子學分類中具有相似性。對于該類樺木屬植物，ITS 分子鑒定能夠快速準確的進行物種鑒別，這與宮霞等[18]對葡萄科各屬的結論和蔡洪月等[19]對杜鵑屬的研究結果相一致。

白樺和垂枝樺在2 個ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹中均聚為一支，支持率大于60%，并且在樺木屬系統(tǒng)發(fā)育樹中處于較原始的位置，這與姜景民[1]和楊萬波等[20]研究樺木屬的進化關系結果類似。白樺與垂枝樺在形態(tài)學聚類中也聚為一支，與《中國植物志》記載的樺木屬分類結果相似，驗證了兩者在ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹中位置的結論。

《中國植物志》分類中甸生樺歸屬于柴樺亞組，鹽樺歸屬于樺木亞組，而《新疆植物志》中兩者被劃分在柴樺亞組。本研究中甸生樺和鹽樺在形態(tài)性狀聚類和ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹上均聚為一支，說明其形態(tài)性狀具有一定的共源性，且ITS 序列同源性較高、遺傳距離較近。本研究結果支持鹽樺與甸生樺分在同一亞組。此外，鹽樺與甸生樺都分布在新疆溫帶草原區(qū)，鹽樺生活型從小喬木演化為與甸生樺相類似的灌木，反映了相似自然生境對植物的生活型有一定影響[1]。同時，王亞玲等[21]在研究木蘭科植物時也有相類似的結果。

3.2 分類群進化及親緣關系

通過主成分分析可以選擇出有效的評價參數和指標，對樺木屬形態(tài)性狀的主成分分析中，生殖器官果苞的形態(tài)特征構成第3 主成分，營養(yǎng)器官枝葉性狀特征構成第2 主成分，這與從古植物學角度分析樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育的研究結果一致[10]。

堅樺亞組、碩樺亞組和西樺組在ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹中各自聚為一支，且支持率均大于50%。在分子水平上，西樺組與樺木組之間距離較大，絕對遺傳距離為0.020 5。樺木組內的堅樺亞組與碩樺亞組之間的遺傳距離為0.017 5，而各自亞組內部絕對遺傳距離為0.011 3 和0.003 3，證實堅樺亞組與碩樺亞組的親緣關系較西樺組的親緣關系近。樺木屬內各組、亞組和種間都表現(xiàn)出高的遺傳相似性，說明ITS 分子標記鑒定技術的高效性和復雜性[4-5]。演化起源上，西樺組分布于我國西南地區(qū)樺木屬原始起源中心[1]，保留的原始性狀比較多，因而與樺木組的堅樺亞組和碩樺亞組遺傳特性明顯，同時也驗證了兩者之間遺傳距離較遠。

樺木亞組、柴樺亞組和黑樺亞組聚為一個混合支，存在不同程度的跨組聚類，與饒龍兵等[22]研究榿木屬中出現(xiàn)的情況一致。這可能是因為黑樺亞組和柴樺亞組與樺木亞組的遺傳距離均比較小，為0.004 7，表明3 個亞組之間的親緣關系比較近。研究結果與姜靜等[11]發(fā)現(xiàn)黑樺亞組和樺木亞組親緣關系較近的結論一致，但與本研究中形態(tài)學聚類結果差異較大。黑樺、糙皮樺和紅樺在形態(tài)學聚類時聚為一個混合類群，但是它們在經典形態(tài)分類學中屬于不同亞組種。新疆樺木屬植物的研究結果中也出現(xiàn)了類似情況，如甸生樺和鹽樺跨亞組聚為一類。推測原因是經典形態(tài)分類學主要以形態(tài)性狀為依據，而植物表型性狀受自然環(huán)境和人為因素的影響，有時難以闡明種質資源表型性狀的差異。特別是樺木屬植物為屬內多倍體木本植物，不同種之間倍性差異大[5,23]，長時間的自然選擇和適應環(huán)境，使得分子遺傳和形態(tài)性狀上不能很好地吻合，導致屬內植物的分類系統(tǒng)十分復雜[24]。ITS 序列在樺木屬各亞組間和亞組內遺傳距離存在一定間隔，可將各種類進行區(qū)分，是樺木屬植物較為理想的DNA 條形碼候選序列。本研究對新疆樺木屬植物的分類及其親緣關系，從分子系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)學聚類進行嘗試，今后研究還需結合更多的樣本及分子手段進行綜合分析。