冷凍快速免疫組化試劑在石蠟組織切片中的應(yīng)用

陳 剛，宋國(guó)新，韓 雪，張煒明

常規(guī)石蠟組織免疫組化染色定位清晰，具有特異性和敏感性，是病理診斷中重要的輔助檢查，但抗體孵育時(shí)間較長(zhǎng)，染色流程平均需2.5～3 h。冷凍快速免疫組化染色應(yīng)用超敏感抗體標(biāo)記技術(shù)，具有特異性、敏感性、操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短的特點(diǎn)，但冷凍組織形態(tài)結(jié)構(gòu)不如石蠟組織清晰，限制了其在臨床中的應(yīng)用。筆者將冷凍快速免疫組化抗體應(yīng)用于常規(guī)石蠟切片免疫組化染色，取得了較好的染色效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取2021～2022年南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院存檔的肺癌蠟塊標(biāo)本10例，其中肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌各5例。

1.2 試劑快速免疫組化一步法專(zhuān)用酶標(biāo)聚合物一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，均購(gòu)自美鑫達(dá)醫(yī)療公司?？焖倜庖呓M化兩步法專(zhuān)用一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，專(zhuān)用酶標(biāo)聚合物二抗，均購(gòu)自賽諾特生物公司。檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)，常規(guī)免疫組化一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，鼠兔通用型MaxVision二抗，DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法肺鱗狀細(xì)胞癌蠟塊每例連續(xù)3 μm厚切片9張，肺腺癌蠟塊每例連續(xù)3 μm厚切片3張，65 ℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水，所有切片均經(jīng)檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)高壓熱修復(fù)12 min后分為3組：A實(shí)驗(yàn)組采用快速免疫組化一步法，B實(shí)驗(yàn)組采用快速免疫組化兩步法，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組采用常規(guī)免疫組化兩步法，分別對(duì)肺癌石蠟切片中腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物CK5/6、p63、CKpan、TTF-1進(jìn)行染色。具體操作步驟：(1)A實(shí)驗(yàn)組：加冷凍快速專(zhuān)用一抗，室溫孵育3 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色3 min。(2)B實(shí)驗(yàn)組：加冷凍快速專(zhuān)用鼠源性一抗，室溫孵育4 min，PBS沖洗3次×1 min，加專(zhuān)用酶標(biāo)抗鼠聚合物二抗室溫孵育3 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色3 min。(3)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組：加常規(guī)福州邁新公司一抗37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次×1 min，加鼠兔通用型MaxVision二抗室溫孵育20 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色5 min。顯色完成后三組切片均經(jīng)蘇木精復(fù)染，常規(guī)封固，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 染色質(zhì)量對(duì)比采用快速免疫組化一步法(A實(shí)驗(yàn)組)、兩步法(B實(shí)驗(yàn)組)，分別對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌石蠟切片中CK5/6、p63、CKpan和肺腺癌石蠟切片中TTF-1進(jìn)行染色。結(jié)果顯示：兩種檢測(cè)方法均定位準(zhǔn)確，背景清晰，染色強(qiáng)度適中(圖1、2)。A、B實(shí)驗(yàn)組染色質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組(圖3)相比，差異無(wú)顯著性。

2.2 染色時(shí)間對(duì)比三組實(shí)驗(yàn)分別記錄免疫組化染色時(shí)間，包括一、二抗孵育、PBS沖洗、DAB顯色時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中快速免疫組化一步法(A實(shí)驗(yàn)組)用時(shí)最短，染色總時(shí)間僅需9 min；快速免疫組化兩步法(B實(shí)驗(yàn)組)用時(shí)稍長(zhǎng)，染色時(shí)間需16 min。A、B實(shí)驗(yàn)組染色時(shí)間均明顯低于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組(表1)。

表1 各組染色時(shí)間對(duì)比分析

3 討論

石蠟組織切片是常規(guī)免疫組化染色首選的標(biāo)本類(lèi)型[1]，其具有細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)好，染色定位清晰，反應(yīng)敏感且特異等特點(diǎn)。免疫組化技術(shù)根據(jù)酶標(biāo)記位置可分為直接法和間接法。直接法是將酶標(biāo)記在一抗上，操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，但因抗體只能結(jié)合有限的酶分子，敏感性較低，且每種特異性抗體均需標(biāo)記，制作成本高。間接法是將酶標(biāo)記于二抗上，在特異性一抗與組織中的抗原反應(yīng)后，再用酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合后顯色，由于二抗對(duì)一抗的多點(diǎn)識(shí)別模式，其染色敏感性更高，通用性更強(qiáng)。隨著酶標(biāo)聚合物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)行石蠟組織常規(guī)免疫組化染色大多采用間接法[2]，為了能達(dá)到良好的染色效果，一、二抗孵育時(shí)間長(zhǎng)，各類(lèi)主流全自動(dòng)免疫組化染色儀實(shí)際染色全流程平均需用時(shí)2.5 h以上。

①A①B②A②B③A③B

冷凍快速免疫組化法與常規(guī)免疫組化法相比，其抗體濃度高且純[3]，既減少抗體的孵育時(shí)間，也保證染色的特異性。在本實(shí)驗(yàn)中，A實(shí)驗(yàn)組(直接法)運(yùn)用獨(dú)特的抗體納米超敏感多聚體直接偶聯(lián)標(biāo)記技術(shù)，將辣根過(guò)氧化物酶多聚體直接標(biāo)記一抗，不僅簡(jiǎn)化操作步驟，更有效提高染色敏感性，整個(gè)染色流程僅需9 min即可達(dá)到良好的染色效果。B實(shí)驗(yàn)組(間接法)二抗采用獨(dú)特的微聚合物層疊技術(shù)，將二抗F(ab′)2片段和酶通過(guò)新型偶聯(lián)化學(xué)在微骨架上分層有序聚合，提升了特異性和敏感度，總?cè)旧珪r(shí)間也僅需16 min就能取得和標(biāo)準(zhǔn)法相同的染色效果。與常規(guī)免疫組化法相比，兩種快速免疫組化法在染色時(shí)長(zhǎng)上優(yōu)勢(shì)明顯，本實(shí)驗(yàn)4種抗體染色定位準(zhǔn)確，背景清晰，強(qiáng)度適中，與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法差異無(wú)顯著性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)將冷凍快速免疫組化試劑應(yīng)用于石蠟組織切片可縮短染色時(shí)間，提高病理診斷的及時(shí)率，減少患者報(bào)告等待時(shí)間。

由于抗體制備成本高、種類(lèi)少等原因，冷凍快速免疫組化試劑尚不能廣泛應(yīng)用于石蠟切片的快速免疫組化染色。隨著抗體制備成本的降低以及超敏酶標(biāo)技術(shù)的發(fā)展，快速石蠟組織免疫組化有望成為未來(lái)免疫組化的發(fā)展方向。