腎穿刺石蠟切片厚度對腎小球系膜區(qū)及基膜PASM染色的影響

梁婷玉，冼志紅

腎穿刺活檢組織病理診斷中，過碘酸六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine， PASM)是重要的檢查方法，主要用于顯示腎小球系膜區(qū)范圍和基膜增厚以及“釘突”、“梯狀”等病理變化，是腎小球疾病鑒別的重要手段之一[1]。PASM染色質(zhì)量對診斷有一定程度的影響。切片過厚腎小球結(jié)構(gòu)重疊，難以分辨，半薄切片制片時(shí)不僅切片難度增加，且切片過薄高溫孵育容易掉片。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多年研究找到一種最佳PASM染色的切片厚度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2021年1～10月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院病理科腎穿刺活檢標(biāo)本30例，其中IgA腎病10例，新月體性腎小球腎炎3例，狼瘡性腎炎、增生硬化性腎小球腎炎和局灶節(jié)段性腎小球硬化癥各4例，腎小球微小病變5例。

1.2 試劑及儀器PASM染色液(六胺銀染色法)購自珠海貝索公司。試劑盒內(nèi)含以下試劑：(1)1%過碘酸；(2)50 mL硼砂溶液、5 g六次甲基四胺銀粉劑；(3)0.25%硫代硫酸鈉水溶液；(4)伊紅染液。標(biāo)本均采用10%中性福爾馬林固定4～6 h，經(jīng)Leica ASP300全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行常規(guī)脫水、使用Leica EG1150H石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，Leica RM2235石蠟切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)切片，切片厚度分別為1、2和3 μm。

1.3 方法(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟入水。(2)1%過碘酸氧化5 min，蒸餾水沖洗。(3)50 mL硼砂溶液+5 g六次甲基四胺銀粉劑充分震蕩混勻，置于62 ℃孵箱預(yù)熱15 min，經(jīng)氧化后的切片浸入60～62 ℃預(yù)熱的六胺銀工作液中30～40 min，工作液開始呈淺棕色，每隔5～10 min鏡下觀察，至腎小球毛細(xì)血管基膜呈黑色，蒸餾水洗2 min ×3次。(4)浸入0.25%硫代硫酸鈉水溶液1～2 min，自來水洗2 min×3次。(5)HE染色10 s，自來水洗。(6)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判讀PASM質(zhì)量根據(jù)腎小球系膜區(qū)及基膜區(qū)域染色進(jìn)行評(píng)分，腎小球囊基膜和腎毛細(xì)血管基膜呈黑色，顯色清晰，細(xì)胞基本無重疊，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，對比強(qiáng)烈為3分。腎小球囊基膜和腎毛細(xì)血管基膜顯色過深或過淺，細(xì)胞部分重疊，細(xì)胞質(zhì)紅色對比不明顯為2分。腎小球囊基膜和腎毛細(xì)血管基膜顯色過深或過淺，無法辨別，細(xì)胞重疊，細(xì)胞質(zhì)紅色無對比為1分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PASM染色質(zhì)量本組PASM染色比較：基膜呈黑色，無重疊，胞質(zhì)為紅色，對比明顯，切片厚度2 μm組評(píng)分(2.65±0.356)略高于1 μm組(2.35±0.425)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。切片厚度1、2 μm組明顯優(yōu)于3 μm組(1.58±0.312，P<0.05)。

2.2 PASM染色三種厚度切片形態(tài)學(xué)比較本組通過三種厚度切片染色比較發(fā)現(xiàn)，切片厚度3 μm組基膜結(jié)構(gòu)較厚，銀染后顯得粗且黑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)重疊現(xiàn)象較嚴(yán)重，導(dǎo)致一部分“釘突”等結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，復(fù)染顏色也難以顯現(xiàn)(圖1)。切片厚度2 μm組細(xì)胞有部分重疊，銀染后基膜呈清晰黑色并有一定的立體感，復(fù)染后著色鮮明，腎小球與周圍組織對比清晰(圖2)。切片厚度1 μm組細(xì)胞重疊較少，基膜顯色清晰，但是復(fù)染對比不清晰(圖3)，且30例切片中有5例掉片。

①A①B②A②B③A③B

3 討論

PASM法是通過過碘酸氧化組織，使腎組織基膜內(nèi)的黏多糖暴露出醛基，醛基將六胺銀還原為黑色的金屬銀，氯化金可調(diào)整顯色度，硫代硫酸鈉對已顯色的銀鹽起固定作用，并除去未反應(yīng)的銀離子，伊紅復(fù)染細(xì)胞質(zhì)。PASM染色可清楚地顯示腎小球基膜及腎小球膜無細(xì)胞物質(zhì)。對腎小球膜的染色優(yōu)于PAS反應(yīng)；對基膜的染色則不如PAS反應(yīng)[2]。因此，腎穿刺活檢病理學(xué)診斷中常同時(shí)使用以互補(bǔ)。

腎穿刺活檢中，不同的特殊染色應(yīng)選擇不同厚度的石蠟切片[3-6]。豆文憲等[4]和喻宏等[5]認(rèn)為腎穿刺活檢石蠟切片1～1.5 μm厚對PAS染色和PASM染色效果最好，細(xì)胞呈單層分布，腎小球系膜顯示纖細(xì)、清晰，無背景著色。李敏等[6]認(rèn)為腎穿刺活檢石蠟切片染色淀粉樣物質(zhì)(剛果紅染色)時(shí)，厚切片(≥5 μm)與薄切片(≤3 μm)相比，其陽性部位著色明顯，顏色鮮艷，結(jié)果穩(wěn)定，可有效減少或避免薄切片的假陰性現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用1 μm厚切片染色后，細(xì)胞單層分布，清晰判別腎小球基膜和系膜，但復(fù)染對比不夠強(qiáng)烈且偶有掉片現(xiàn)象。2 μm厚切片腎小球基膜和系膜清晰可見，略有重疊增加了切片立體感，復(fù)染后腎小球與周圍組織對比明顯，且30例2 μm組切片均未掉片。3 μm厚切片細(xì)胞結(jié)構(gòu)重疊明顯，一部分結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，復(fù)染顏色也難以顯現(xiàn)。本組認(rèn)為切片2 μm厚是最佳PASM染色的厚度。

在常規(guī)檢查過程中≤3 μm的切片即為半薄切片，制作半薄切片對于蠟塊硬度要求較高，在實(shí)際操作中可以把蠟塊及嶄新鋒利刀片置于冰箱-18 ℃冷凍約0.5 h，使其充分冷卻再行切片，制作的切片過程比較順利，切片質(zhì)量也較高。另外，PASM染色法中，硼砂-六胺銀工作液必須充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用，未使用的試劑日常保存應(yīng)注意避光4 ℃低溫存放，按試劑說明書要求，工作液應(yīng)提前62 ℃水浴鍋預(yù)熱15 min后將氧化后切片放入工作液，30 min后觀察工作液顏色變化，每5 min鏡下觀察顯色程度以避免過染現(xiàn)象?！杜R床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊》[7]推薦PASM染色孵育溫度為60 ℃，為提高工作效率及降低背景著色，本試劑調(diào)整了硼砂-六胺銀工作液濃度，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)溫度為62 ℃，不僅縮短了反應(yīng)時(shí)間，著色效果也更佳。

在實(shí)際操作中，本研究使用自配六胺銀染液對1 μm厚度切片進(jìn)行染色，其掉片率較高，可能與氧化試劑濃度過高有關(guān)：自配過碘酸試劑濃度為2%，而商品化試劑盒中過碘酸濃度為1%。另外，切片經(jīng)62 ℃孵育時(shí)間過久也會(huì)引起掉片，60 ℃或62 ℃孵育30 min內(nèi)對掉片率無明顯影響，為避免掉片現(xiàn)象，于工作液中作用30 min后的切片應(yīng)密切關(guān)注染色情況。

腎穿刺活檢病理切片是一種既傳統(tǒng)又經(jīng)典的制片技術(shù)，要制作一張優(yōu)質(zhì)的PASM染色切片影響因素較多，如切片厚度、染色時(shí)間、溫度、試劑濃度等。隨著診斷要求的提高，病理技師在制作切片的時(shí)候應(yīng)多思考，詳細(xì)了解每種特殊染色的原理及其染色物質(zhì)的要求，對于不同組織化學(xué)染色，把控多種干擾因素，采用不同厚度可以有效提高診斷效率，減少因切片厚度引起的假陰性或假陽性。