TGF-β1通過介導(dǎo)上皮-間葉轉(zhuǎn)化促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

李玲玉，彭戴君，楊海生，朱絢麗，張雯雯，官 兵

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最常見，約占TC總數(shù)的80%[2]。盡管PTC具有惰性生物學(xué)行為，早期診斷和手術(shù)治療效果較好[3]。然而，TC一旦發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加[4]。因此，探討PTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[5]是近年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制相關(guān)[6-7]。TGF-β/Smad信號通路因與EMT密切關(guān)聯(lián)，而備受關(guān)注[8]。TGF-β超家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積、胚胎發(fā)生、炎癥反應(yīng)和器官纖維化中起重要作用[9]。其中，TGF-β1的含量最高，活性最強(qiáng)，并且在細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究中應(yīng)用較多[10-11]。本文著重分析TGF-β1介導(dǎo)的EMT在PTC增殖和侵襲中的作用，為臨床防治PTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2021年上海市第六人民醫(yī)院金山分院存檔的44例PTC石蠟包埋標(biāo)本，其中合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本18例。患者均經(jīng)兩名病理醫(yī)師確診，均無糖尿病、高血壓、腦血管病等?；颊咝g(shù)前均無其他系統(tǒng)惡性腫瘤，標(biāo)本病理類型均為經(jīng)典型乳頭狀癌亞型。

1.2 試劑人PTC細(xì)胞系BCPAP購自上海細(xì)胞庫；誘導(dǎo)因子rh-TGF-β1和rh-BMP7購自美國R&D公司。一抗E-cadherin(CST-14472, 1 ∶50)、vimentin(CST-5741, 1 ∶100)、TGF-β1(Santa Cruz, sc-146, 1 ∶100)、Smad2/3(Santa Cruz, sc-8332, 1 ∶50)、E-cadherin(CST-14472, 1 ∶1 000)、vimentin(Abcam,Ab92547, 1 ∶2 000)、N-cadherin(Abcam,Ab76011, 1 ∶5 000)、p-Smad2/3(Abcam-Ab254407, 1 ∶1 000)、Smad7(Proteintech, 2584-1-AP, 1 ∶1 000)、GAPDH(Proteintech, 60004-1-Lg, 1 ∶10 000)和IgG二抗(Beyotime, A0208, 1 ∶1 000)；引物設(shè)計(jì)與合成由上海生工公司完成；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，購自北京天根生化公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，其中PTC 44張、癌旁正常組織(normal tissues， NT)44張和有癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(metastatic lymph nodes, MLN)26張。免疫組化采用EnVision法染色，烤片，切片脫蠟及水化，EDTA抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育一、二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水返藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥，樹膠封固。

1.3.2結(jié)果判讀 E-cadherin以細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒為陽性，TGF-β1、vimentin以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性，Smad2/3以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性。同時(shí)由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行判讀。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)<1%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項(xiàng)評分結(jié)果相乘：0～1分為陰性(-)；2～4分為弱陽性(+)；5～8分為強(qiáng)陽性()；9～12分為強(qiáng)陽性()。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)因子處理 BCPAP細(xì)胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。待細(xì)胞長到70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，換無血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，添加誘導(dǎo)因子分為空白對照組(NC，PBS代替誘導(dǎo)因子)、rh-TGF-β1組(rh-TGF-β1濃度為10 ng/mL)、rh-TGF-β1+rh-BMP7組(10 ng/mL rh-TGF-β1+5ng/mL rh-BMP7)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪于96孔板，每孔鋪100 μL細(xì)胞，每個(gè)樣品設(shè)7個(gè)復(fù)孔，邊緣孔加入100 μL無菌水或者PBS。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測前加入10 μL的CCK-8于孔中，2 h后，酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度(optical density， OD)值。

1.3.5Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升6×104個(gè)；在下室(即24孔板底部)加入700 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入500 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出小室，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μL多聚甲醛的孔中，室溫固定30 min。取出小室，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800 μL結(jié)晶紫染液的孔中，室溫染30 min。用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出小室，吸去上室液體，擦去上室底部膜表面細(xì)胞。用小鑷子揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封固。顯微鏡下取10個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.6qRT-PCR 總RNA由TRIzol提取，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物Smad2上游引物：5′-TTCAGTTCCGCCTCCAATCG-3′，下游引物：5′-GCAAGCCACGCTAGGAAAAC-3′；Smad3上游引物：5′-ATGTCATCTACTGCCGCCTG-3′，下游引物：5′-TAGGGATTCACGCAGACCTC-3′；Smad7上游引物：5′-CCTTAGCCGACTCTGCGAA-3′，下游引物：5′-CCCTGTTTCAGCGGAGGAA-3′；N-cadherin上游引物：5′-GCCCAAGACAAAGAGACCCA-3′，下游引物：5′-TGGCCACTGTGCTTACTGAA-3′；vimentin上游引物：5′-AGTCCGCACATTCGAGCAAA-3′，下游引物：5′-AACTTACAGCTGGGCCATCG-3′；E-cadherin上游引物：5′-CCCAGGAGCCAGACACATTT-3′，下游引物：5′-TTAGGGCTGTGTACGTGCTG-3′。以互補(bǔ)DNA為模板，按照qRT-PCR說明書行定量PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)部對照。采用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR的數(shù)值；統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用GraphPad PRISM 8.0軟件進(jìn)行分析。

1.3.7Western blot實(shí)驗(yàn) 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA試劑，裂解BCPAP細(xì)胞提取總蛋白。應(yīng)用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定所提取蛋白樣品的純度和濃度。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用PVDF膜進(jìn)行染色、封閉、孵育一、二抗，采用高靈敏ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光并采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中EMT標(biāo)志物和TGF-β1、Smad2/3的表達(dá)本組對44例PTC、44例NT和26例MLN進(jìn)行E-cadherin和vimentin的免疫組化檢測，E-cadherin在NT、PTC和MLN中表達(dá)水平評分平均值分別為12.00、5.60、5.52；vimentin在NT、PTC和MLN中表達(dá)水平評分平均值分別為4.00、9.00、9.52；與NT相比，PTC和MLN中E-cadherin表達(dá)水平下降，vimentin表達(dá)水平升高(圖1)。與NT相比，35例PTC中E-cadherin表達(dá)減少，并同時(shí)伴vimentin表達(dá)增加(79.5%，35/44)，21例MLN中E-cadherin表達(dá)減少(+)，并同時(shí)伴vimentin表達(dá)增加(～)(81%，21/26)，上皮標(biāo)志物E-cadherin和間葉標(biāo)志物vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示與正常甲狀腺濾泡相比，PTC和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中均發(fā)生EMT現(xiàn)象。在PTC中TGF-β1和Smad2/3的陽性率分別為70.5%(31/44)和65.9%(29/44)，明顯高于NT中TGF-β1和Smad2/3的陽性率[20.5%(9/44)和18.2%(8/44)]，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)。MLN中TGF-β1和Smad2/3的陽性率進(jìn)一步升高，分別為76.9%(20/26)和69.2%(18/26)，但與PTC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。在31例TGF-β1陽性的PTC中有29例同時(shí)Smad2/3陽性，而在TGF-β1陰性的組織中Smad2/3也呈陰性，提示Smad2/3與TGF-β1的表達(dá)一致(Kappa=0.895，P<0.001)。

NTPTCMLNE-cadherinvimentinTGF-β1Smad2/3

2.2 TGF-β1對PTC細(xì)胞形態(tài)的影響三組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，與NC組相比，rh-TGF-β1組細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變得松散，離散成單個(gè)的細(xì)胞呈梭形、紡錘形，細(xì)胞由上皮樣形態(tài)向間葉形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變(圖2A)。

2.3 TGF-β1對PTC細(xì)胞增殖的影響三組細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)0、24、48、72 h后經(jīng)CCK-8檢測，酶標(biāo)儀檢測OD值。結(jié)果顯示：與NC組相比，rh-TGF-β1組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，rh-BMP7可以抑制TGF-β1的促細(xì)胞增殖能力，48 h的OD值為0.154、0.185、0.163，72 h的OD值為0.189、0.244、0.207，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 TGF-β1對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞形態(tài)、增殖和侵襲的影響：A.鏡下示rh-TGF-β1組細(xì)胞由上皮樣形態(tài)向間葉細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變；B.CCK-8實(shí)驗(yàn)示rh-TGF-β1組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；C.Transwell實(shí)驗(yàn)示rh-TGF-β1組細(xì)胞穿過小室基膜的細(xì)胞數(shù)增加；NC.空白對照組；*P<0.05，**P<0.01

2.4 TGF-β1對PTC細(xì)胞侵襲的影響與NC組相比，添加rh-TGF-β1組BCPAP細(xì)胞穿過小室基膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P=0.000 2)，說明TGF-β1可以明顯促進(jìn)PTC細(xì)胞的侵襲。同時(shí)，添加rh-TGF-β1和rh-BMP7組細(xì)胞穿過基膜的數(shù)量比rh-TGF-β1組明顯減少(P=0.024 2)，提示BMP7可以抑制TGF-β1的促細(xì)胞侵襲作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C)。

2.5 TGF-β1對PTC細(xì)胞EMT標(biāo)志物和TGF-β/Smad信號通路標(biāo)志物在mRNA水平表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示：TGF-β1可以增加TGF-β/Smad信號通路標(biāo)志物Smad2(1.229±0.016)、Smad3(2.208±0.084)的表達(dá)，BMP7可以抑制Smad2(1.016±0.171)、Smad3(1.080±0.185)的表達(dá)，上調(diào)Smad7(1.729±0.084)的表達(dá)(P<0.05，圖3A)。TGF-β1可以誘導(dǎo)上皮標(biāo)志物E-cadherin(0.525±0.029)的下調(diào)和間葉標(biāo)志物vimentin(1.974±0.194)、N-cadherin(1.590±0.166)的上調(diào)，而BMP7可以抑制TGF-β1促EMT作用(P<0.05，圖3B)，

2.6 TGF-β1對PTC細(xì)胞EMT標(biāo)志物和TGF-β/Smad信號通路標(biāo)志物在蛋白質(zhì)水平表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TGF-β1可以增加p-Smad2/3(0.669±0.022)的表達(dá)，BMP7可以抑制p-Smad2/3(0.551±0.032)，上調(diào)抑制性蛋白Smad7(1.106±0.088)的表達(dá)(P<0.05，圖3C)。TGF-β1可以誘導(dǎo)上皮標(biāo)志物E-cadherin(0.254±0.009)的下調(diào)和間葉標(biāo)志物vimentin(0.473±0.062)、N-cadherin(0.404±0.018)的上調(diào)，BMP7可以抑制TGF-β1促EMT作用(P<0.05，圖3D)。

圖3 TGF-β1對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物和TGF-β/Smad信號通路標(biāo)志物表達(dá)的影響：A.qRT-PCR檢測TGF-β1與TGF-β/Smad信號通路標(biāo)志物Smad2、Smad3的關(guān)系；B.qRT-PCR檢測TGF-β1與上皮標(biāo)志物E-cadherin和間葉標(biāo)志物vimentin、N-cadherin的關(guān)系；C.Western blot法檢測TGF-β1與Smad7、p-Smad2/3表達(dá)的關(guān)系；D.Western blot法檢測TGF-β1與上皮標(biāo)志物E-cadherin和間葉標(biāo)志物vimentin、N-cadherin的關(guān)系；NC.空白對照組；ns.差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

PTC是TC中最常見的病理類型，約占TC的80%。PTC雖然具有惰性生物學(xué)行為，經(jīng)過合理的診斷和治療預(yù)后良好，但仍有較多的PTC患者，尤其是合并淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，易復(fù)發(fā)且預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[12]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為PTC高侵襲性的臨床病理特征之一，與PTC的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]，研究PTC侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對于早期識別合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC，及時(shí)確定其有效的診斷和治療措施具有重要意義。

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為具有游走能力的間葉細(xì)胞的過程，因此認(rèn)為EMT與細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。EMT的主要分子學(xué)標(biāo)志是上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下降和間葉標(biāo)志物vimentin、N-cadherin等的表達(dá)上調(diào)[15]。本組首先收集PTC患者的石蠟標(biāo)本，檢測其EMT標(biāo)志物的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NT相比，PTC和MLN中分別有79.5%(35/44)和81%(21/26)病例中E-cadherin的表達(dá)減少，并伴vimentin的表達(dá)增加，提示PTC中存在EMT現(xiàn)象。本組檢測石蠟切除標(biāo)本中TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NT相比，PTC和MLN中TGF-β1和Smad2/3的陽性率明顯升高，提示TGF-β1和Smad通路蛋白在PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

Kaimori等[16]將體外培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中加入TGF-β1誘導(dǎo)因子，發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變，并且檢測到其上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下降，而間葉標(biāo)志物vimentin、FSP-1等的表達(dá)升高，提示TGF-β1可以在體外誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。國內(nèi)外關(guān)于EMT的研究多將TGF-β1作為誘導(dǎo)因子[17-19]。由于TGF-β/Smad通路與EMT過程密切相關(guān)[20-23]，本組將TGF-β/Smad通路作為TGF-β1誘導(dǎo)PTC細(xì)胞發(fā)生EMT的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行分析。TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[24]：TGF-β與細(xì)胞膜上的TβRⅡ結(jié)合，激活TβRⅠ，TβRⅠ使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)核轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2/3磷酸化，磷酸化后的Smad2/3與Smad4形成三聚體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子共同調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄。Smad7是抑制型Smad，能夠抑制Smad2/3的磷酸化，阻斷R-Smads的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。BMP7與TGF-β1在結(jié)構(gòu)上有諸多相似[26]，可通過阻斷TGF-β/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，增加Smad7的表達(dá)抑制TGF-β1的作用[27]。因此，本實(shí)驗(yàn)中將BMP7用作TGF-β/Smad信號通路的抑制因子。本課題組在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中設(shè)置NC組、rh-TGF-β1組和rh-TGF-β1+rh-BMP7組，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，用qRT-PCR和Western blot法檢測EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達(dá)變化和Smad通路標(biāo)志物Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2/3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TGF-β1可誘導(dǎo)BCPAP細(xì)胞由上皮樣形態(tài)向間葉形態(tài)轉(zhuǎn)變，明顯增強(qiáng)其增殖和侵襲能力，并且誘導(dǎo)上皮標(biāo)志物E-cadherin的下調(diào)和間葉標(biāo)志物vimentin、N-cadherin的上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT，BMP7可以抑制TGF-β1促細(xì)胞增殖、侵襲及EMT的作用。TGF-β1可以促使Smad2、Smad3及p-Smad2/3的水平升高，BMP7可以抑制Smad2、Smad3的表達(dá)及Smad2/3蛋白的磷酸化，增加抑制型蛋白Smad7的表達(dá)，提示BMP7通過作用于TGF-β/Smad信號通路抑制TGF-β1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果只在一種PTC細(xì)胞系中得到驗(yàn)證，后續(xù)需進(jìn)一步在多細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動物中驗(yàn)證。

綜上所述，PTC及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)本發(fā)生EMT現(xiàn)象且TGF-β1和Smad2/3呈高表達(dá)；TGF-β1通過TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)EMT，促進(jìn)PTC的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本組結(jié)果對早期診斷有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性傾向的PTC患者具有重要的臨床意義，也為尋找預(yù)防和治療PTC轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。