長期施用綠肥對小麥玉米間作土壤微生物的影響

許小虎，車宗賢，2，趙 旭，崔 恒，2，張久東，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.農(nóng)業(yè)部甘肅耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測試驗(yàn)站，甘肅 武威 733017)

綠肥作為一類純天然的肥料，將其翻壓還田可以有效提高土壤的有機(jī)質(zhì)含量[9]，改善土壤理化性質(zhì)，為微生物的生長繁殖提供良好的環(huán)境[10]。萬水霞等[11]研究表明，與不施肥的土壤相比，長期施用綠肥的土壤中微生物總量顯著增加了58.09%～86.86%，尤其是細(xì)菌數(shù)量增加了77.93%～112.76%。高菊生等[12]研究表明，與冬閑處理相比，綠肥還田能促進(jìn)水稻增產(chǎn)，其增產(chǎn)穩(wěn)定性較好，還能顯著增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤全氮、堿解氮含量，加速土壤礦化，促進(jìn)水稻對磷素及鉀素的吸收。李文廣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃土高原旱地麥后復(fù)種飼料油菜還田后，有效改善了土壤細(xì)菌群落組成，增加了有益菌的豐度，酸桿菌門、芽單胞菌門以及硝化螺旋菌門豐度顯著增加。

Biolog技術(shù)由美國Biolog公司于1989年研發(fā)，能夠用于鑒定細(xì)菌、霉菌等多種微生物，并且可以判斷微生物群落的代謝活性以及生長發(fā)育情況[14]。高通量測序技術(shù)是目前應(yīng)用最為普遍的測序技術(shù)，與傳統(tǒng)的基因測序方法相比，它具有靈敏性高、準(zhǔn)確性高以及成本較低的特點(diǎn)，通過檢測土壤微生物的遺傳物質(zhì)，能夠準(zhǔn)確、全面、快速地了解土壤微生物群落的復(fù)雜性以及多樣性[15-16]。本研究基于農(nóng)業(yè)部甘肅耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測試驗(yàn)站長期定位試驗(yàn)田(1988，灌漠土)，利用Biolog技術(shù)以及高通量測序技術(shù)研究長期施用綠肥對土壤養(yǎng)分、微生物代謝功能及微生物群落組成的影響，探討長期施用綠肥對土壤肥力的影響，以期為建立科學(xué)的施肥制度、提高土壤肥力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)業(yè)部甘肅耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測試驗(yàn)站長期定位試驗(yàn)田(102°40′E，38°37′N)，地處溫帶大陸性干旱氣候區(qū)，海拔1 504 m，年均氣溫7.7℃，降水量150 mm，蒸發(fā)量2 021 mm，日照時(shí)數(shù)3 023 h，無霜期約150 d。試驗(yàn)地土壤為灌漠土，長期定位試驗(yàn)于1988年開始，初始耕層(0～20 cm)土壤基本理化性質(zhì)為：速效鉀180 mg·kg-1，pH值8.8，容重1.4 g·cm-3，孔隙度47.8%，有機(jī)質(zhì)16.4 g·kg-1，全氮1.06 g·kg-1，全磷1.50 g·kg-1，有效磷13.0 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究設(shè)置了5個(gè)不同施肥處理，分別為綠肥(G)、化肥(N)、農(nóng)家肥(M)、小麥秸稈(S)、不施肥(CK)，每個(gè)處理3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列，小區(qū)面積為31.05 m2(6.9 m×4.5 m)。綠肥主要為箭筈豌豆鮮草(含有機(jī)質(zhì)455～504 g·kg-1，全氮36.9～40.1 g·kg-1，全磷5.42～7.00 g·kg-1，全鉀28.4～30.3 g·kg-1)，秸稈主要為小麥秸稈；綠肥與小麥秸稈分別在前一年10月初鍘成20 cm左右的小段，翻壓在30 cm的耕層內(nèi)，隨即灌水，以利腐解。農(nóng)家肥為牛糞(含有機(jī)質(zhì)180～220 g·kg-1，全氮1.78～2.05 g·kg-1，全磷1.83～2.58 g·kg-1，全鉀23.1～30.0 g·kg-1)，播種前將其粉碎后翻壓在30 cm的耕作層內(nèi)。綠肥、小麥秸稈、農(nóng)家肥全部作為基肥一次性施入土壤；化肥主要為尿素，施用方法為20%基施+80%追施。綠肥和小麥秸稈的施用量分別為每公頃農(nóng)田鮮綠肥或小麥秸稈的平均產(chǎn)量，而化肥與農(nóng)家肥的施用量為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶施用肥料的最佳量。除不施肥處理(CK)外，其余處理均在小麥播種前基施磷肥(P2O5)150 kg·hm-2，除化肥處理外的其他處理全生育期不再施肥，具體施肥方案見表1。

表1 施肥方案Table 1 Fertilization scheme

供試玉米為‘利單295’，小麥為‘寧春53號’。試驗(yàn)地為小麥玉米間作田(每年3月中旬播種小麥，4月中旬播種玉米，間作模式為小麥—玉米—小麥)，且每年倒茬(倒茬次序?yàn)?月底收獲小麥，10月中旬收獲玉米，收獲后統(tǒng)一翻地，來年種小麥的行改種玉米)。單種小麥播種量為375 kg·hm-2，帶田小麥播種量為225 375 kg·hm-2，玉米保苗67 500株·hm-2；小麥玉米帶田采用150 cm帶幅(小麥∶玉米=70 cm∶80 cm)。播種、除草、配藥、收獲等農(nóng)事均為人工操作，3月中旬播種小麥，4月中上旬出苗，7月中旬收獲；4月中下旬覆膜播種玉米，5月初出苗，10月初收獲。熟制為一年一熟。

1.3 土壤樣品采集

于2020年7月小麥?zhǔn)斋@后進(jìn)行取樣，采用對角線采樣法按不同處理取0～20 cm耕層土樣3份，將3份土樣混合均勻，共計(jì)15個(gè)土壤混合樣。去除根系、枯落物，將土樣裝入滅菌自封袋中，放入裝有冰塊的保溫箱，帶回實(shí)驗(yàn)室立即冷藏，一部分過篩冷凍用于測定土壤微生物，一部分自然風(fēng)干常溫保存，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.4 Biolog-ECO測定方法以及高通量測序

取10 g新鮮土壤樣品，置于已滅菌的裝有90 mL 0.85% NaCl 溶液的三角瓶中，25℃、200 r·min-1條件下振蕩30 min，并用NaCl溶液稀釋到10-3g·mL-1后，向ECO微平板的96孔中分別加入150 μL稀釋液，將接種好的Biolog-ECO板于25°C黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每隔24 h在Biolog微平板讀數(shù)儀上測定590 nm與750 nm波長下吸光值，并用OD590值與OD750值的差值來表征代謝活性[17-18]。

平均顏色變化率(Average well color development,AWCD) 表示土壤微生物利用碳源的能力，采用Biolog微平板培養(yǎng)240 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分析采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)。

平均顏色變化率：AWCD=∑(Ci-R)/N

Shannon指數(shù)：H′=-∑pi(lnpi)

式中,Ci為第i個(gè)非對照孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，N為微孔板中所含的31種碳源數(shù)量；ni為第i孔的相對吸光值(Ci-R)，pi為第i孔的相對吸光值與整個(gè)微平板所有相對吸光值總和的比值(Ci-R)/∑(Ci-R)。

高通量技術(shù)使用338F(ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTW TCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3 min; 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)；然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后10℃進(jìn)行保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA純化回收試劑盒回收。PCR回收產(chǎn)物后，用QuantusTM Fluorometer (Promega，USA) 對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用 NEXTFLEXRRapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫：(1)接頭鏈接；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；(4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。最后將PCR產(chǎn)物利用Illumina公司Miseq PE300平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行測序[19]。

1.5 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用酸度計(jì)電位法測定[20]，土壤有機(jī)質(zhì)、土壤速效鉀、土壤速效磷含量分別采用重鉻酸鉀外加熱法GB 9834-88、火焰光度計(jì)法GB 7856-87、鉬銻抗比色法GB 7853-87測定[21]，土壤含水率采用烘干法測定[21]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016以及SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較(α=0.05)。用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，運(yùn)用 Excel 2016及Origin 2019繪圖。土壤微生物高通量測序數(shù)據(jù)基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(http://edu.majorbio.com/lesson/1463)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期施用綠肥對土壤理化性質(zhì)的影響

不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)的影響如表2所示，不同施肥條件下，處理G的pH值與處理N、處理CK存在顯著性差異且前者較后2個(gè)處理分別下降了0.75%和2.86%；處理G的土壤有機(jī)質(zhì)含量與處理N、處理CK存在顯著性差異，且前者較后2個(gè)處理分別高出42.64%和45.67%；處理M全氮含量高于其他處理，但各處理間差異不顯著；處理G的速效磷和速效鉀含量均顯著高于處理N和CK，速效磷分別提高了156.05%、1 233.40%，速效鉀分別提高了70.66%和16.08%；處理M的速效磷與速效鉀含量均遠(yuǎn)高于其他處理。長期施用綠肥可有效提高土壤中的有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀含量，且可以降低土壤pH值。

表2 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)(2020年)Table 2 Soil physical and chemical properties of different fertilization treatments (2020)

2.2 長期施用綠肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 對土壤微生物群落AWCD值的影響 不同處理AWCD變化曲線如圖1所示，土壤微生物對碳源的利用率隨著時(shí)間的增長而逐漸上升，且呈“S”型變化，在24～48 h內(nèi)增長緩慢，48～120 h增長速度加快，168 h達(dá)到峰值后趨于穩(wěn)定。因168 h為AWCD值拐點(diǎn)，故選取168 h的土壤微生物AWCD值進(jìn)行方差分析。168 h時(shí)，處理G的AWCD值與處理N、處理CK存在顯著性差異且前者較后2個(gè)處理分別高出21.78%和32.26%；處理M與處理CK有顯著性差異，M較CK提高21.04%；不同施肥條件下的土壤微生物AWCD值表現(xiàn)為G>M>S>N>CK。處理G的土壤微生物AWCD值在第168 h達(dá)到最高值，且高于其他時(shí)間段的其他處理；處理G與處理M的土壤微生物AWCD值在各時(shí)間段均高于其他處理，說明長期施用綠肥可顯著提高土壤微生物的多樣性及微生物群落的活性。

圖1 平均顏色變化率Fig.1 Average color change rate

2.2.2 對土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響 不同處理土壤微生物的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)如圖2、圖3、圖4所示。168 h時(shí)，處理M與處理N的Shannon指數(shù)之間存在顯著性差異，處理M比處理N提高了1.50%；處理G、處理S以及處理M均與處理N在Simpson指數(shù)上存在顯著性差異，3個(gè)處理分別較處理N提高了0.21%、0.17%和0.22%；處理G與處理N、處理CK的McIntosh指數(shù)之間存在顯著性差異，處理G比處理N、處理CK分別提高了18.46%和29.07%。5種不同施肥條件下，土壤微生物的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)在168 h均達(dá)到了穩(wěn)定，且5種處理的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)在第168 h有高度一致性。24～120 h，處理N的McIntosh指數(shù)均低于處理CK。

圖2 Shannon指數(shù)變化圖Fig.2 Shannon index change chart

圖3 Simpson指數(shù)變化圖Fig.3 Simpson index change chart

圖4 McIntosh指數(shù)變化圖Fig.4 McIntosh index change chart

2.2.3 對土壤微生物碳源代謝能力的影響 如圖5所示，不同施肥處理下土壤微生物對31種碳源的利用能力存在顯著性差異。處理G的土壤微生物碳源代謝能力最強(qiáng)；處理G與M的土壤微生物代謝能力大于1.0的碳源最多，有28種，占總碳源的90.32%；處理N的土壤微生物代謝能力大于1.0的碳源有20種，占總碳源的64.52%；處理CK僅有14種，占總碳源的45.16%。各個(gè)處理均對4-羥基苯甲酸、r-羥基丁酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸以及衣康酸有著較高的利用能力，而均對a-丁酮酸、D,L-a-甘油、甘氨酰-L-谷氨酸利用率較差。

圖5 微生物168 h碳源利用聚類熱圖Fig.5 Clustering heatmap of microbial 168 h carbon source utilization

處理N與處理CK的土壤微生物對酯類、醇類以及一些氨基酸類的利用率較差，對葡萄糖-1-磷酸鹽、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、D-半乳糖酸γ內(nèi)脂、I-赤藻糖醇、2-羥苯甲酸、腐胺利用率均低于其他處理；處理G對酸類碳源的利用明顯高于其他處理；處理G與處理M的土壤微生物對L-苯基丙氨酸的利用率明顯高于其他處理?？梢?，處理G與M對土壤碳源的代謝能力最強(qiáng)。

通過聚類分析可以看出，處理G與M的土壤微生物對碳源的代謝能力相似，處理N與CK的土壤微生物對碳源的代謝能力相似；通過聚類分析將碳源分為6類，土壤微生物對酸類碳源與單糖/糖苷/聚合糖類碳源的利用情況相似，而對胺類、酯類以及醇類碳源利用情況相似。

2.2.4 土壤微生物群落的Alpha多樣性分析 利用生信云平臺對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，從15個(gè)土壤樣品中共獲得647 949條高質(zhì)量且有效的細(xì)菌基因序列，通過97%的OTU聚類后獲得4 640個(gè)細(xì)菌OTUs。由表3可知，不同施肥條件下0～20 cm土層土壤樣本Shannon指數(shù)大體相似；Coverage指數(shù)均大于0.97，說明各個(gè)土壤樣本中基因序列被檢出率很高，能夠正確合理地反映各個(gè)土壤樣本中細(xì)菌群落的多樣性情況；處理G與處理N、處理CK在Simpson指數(shù)上存在顯著差異，表明在不同類型施肥土壤樣本中細(xì)菌群落多樣性存在顯著差異，表現(xiàn)為G>CK>N；處理G、處理S、處理M的OTU數(shù)目均明顯高于處理N；處理N和處理CK的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于其他3個(gè)處理。

表3 各土壤樣品微生物多樣性指數(shù)表Table 3 Microbial diversity index of soil samples

2.2.5 對土壤細(xì)菌門水平上群落結(jié)構(gòu)的影響 將各處理土壤樣品中得到的OTU，在不同水平上進(jìn)行物種注釋，選取相對豐富度大于1.0%的細(xì)菌門分析樣品中細(xì)菌群落的組成。如圖6所示，不同施肥條件下土壤細(xì)菌門水平的群落結(jié)構(gòu)基本一致，包括11個(gè)細(xì)菌門：Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Chloroflexi、Firmicutes、Bacteroidota、Myxococcota、Gemmatimonadota、Planctomycetota、Methylomirabilota和Nitrospirota；其中Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Chloroflexi、Firmicutes為優(yōu)勢菌門。處理G中放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度最高，占總豐度的29.95%，分別比處理CK和處理N提高了21.35%和16.86%；變形菌門(Proteobacteria)相對豐度占20.45%，略高于處理N與處理CK；酸桿菌門(Acidobacteriota)相對豐度最低，占13.39%，而處理CK與處理N最高，分別占19.71%和18.23%；綠彎菌門(Chloroflexi)占比也較低，為11.4%，而處理CK與處理N的相對豐度分別為14.56%和13.43%。處理M的厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度最高，為12.98%，處理CK最低，為3.54%，而處理G的相對豐度明顯高于處理CK與處理N。

圖6 不同施肥條件下各土壤細(xì)菌群落在門水平的相對豐度Fig.6 Relative abundance of soil bacterial communities at phylum level under different fertilization conditions

不同施肥條件下，長期施用綠肥處理的變形菌門(Proteobacteria)相對豐度高于其他處理，酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度則表現(xiàn)出相反的變化趨勢。擬桿菌門(Bacteroidota)、粘球菌門(Myxococcota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)等在長期不同施肥條件下土壤中的相對豐度變化不明顯。此外，厚壁菌門(Firmicutes)僅在施用農(nóng)家肥以及綠肥的土壤中大量存在，分別占總豐度的12.98%和7.29%，其他施肥土壤中豐度不足4.00%。

2.2.6 對土壤細(xì)菌屬水群落結(jié)構(gòu)的影響 對不同處理土壤細(xì)菌OTU豐度排名前20的屬進(jìn)行聚類分析，如圖7所示，處理G增加了芽孢桿菌屬(Bacillus)、斯科爾曼菌屬(Skermanell)、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)豐度，分別比處理N提高了126.06%、65.27%和317.12%；處理G還增加了鏈霉菌(Streptomyces)和類諾卡氏菌(Nocardioides)的豐度，分別比處理N提高了43.12%和27.01%。而處理G中OTU>500的有10類，處理CK中有12類，處理N中有11類。除了不施肥對照與單施氮肥處理，其他3種施肥處理均降低了RB41的豐度。未鑒別的細(xì)菌種類在各個(gè)土壤樣本中也以極高的豐度水平存在。通過聚類分析可以看出，處理N與處理CK對土壤細(xì)菌群落屬水平上影響情況類似，處理S與處理M情況類似；而從細(xì)菌種類的角度來看，芽孢桿菌屬(Bacillus)、蓋拉菌屬(Gaiella)以及芽生球菌屬(Blastococcus)在不同施肥條件下相對豐度情況類似，相對豐度較高；類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)以及斯科爾曼菌屬(Skermanella)情況類似，相對豐度均較低。

注：norank_f_...代表目前未鑒別的細(xì)菌種類。Note: norank_ f_... represents currently unidentified bacterial species.圖7 不同施肥條件下各土壤細(xì)菌群落在屬水平聚類熱圖Fig.7 Heatmap of soil bacterial communities at genus level under different fertilization conditions

2.2.7 不同施肥處理土壤微生物β多樣性分析 不同施肥條件下土壤細(xì)菌門水平主坐標(biāo)分析(PCoA)如圖8所示，第1主坐標(biāo)軸(PC1)與第2主坐標(biāo)軸(PC2)對樣本組成差異的解釋度分別為47.59%和26.69%，2個(gè)主坐標(biāo)軸累積解釋度達(dá)74.28%，說明其可以代表土壤微生物門水平群落組成的特征。處理G與處理CK、處理N在PC1軸上明顯分開，而處理M與其他樣本在PC2軸上明顯分開，說明處理G與CK、N在土壤細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，而處理M與其他處理存在顯著差異。

圖8 不同施肥條件下土壤細(xì)菌門水平群落主坐標(biāo)分析(PCoA)Fig.8 Principal coordinate analysis of horizontal community of soil bacteria on phylum level under different fertilization conditions (PCoA)

2.3 長期不同施肥條件下環(huán)境因子對土壤細(xì)菌群落的影響

2.3.1 基于Biolog-ECO長期不同施肥對土壤微生物群落多樣性的影響 為了進(jìn)一步研究土壤微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，采用r語言中Vagen法進(jìn)行RDA分析，結(jié)果如圖9所示。各指標(biāo)用帶箭頭的矢量線表示，連線的長短表示微生物群落特征與該環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)的大小，箭頭連線與排序軸的夾角表示該環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性，與排序軸的夾角越小，該指標(biāo)與排序軸的相關(guān)性越大[22]。從圖9可以看出，6個(gè)環(huán)境因子對微生物群落的影響均表現(xiàn)出顯著性，RDA1和RDA2解釋率分別為66.45%和2.95%，其中對微生物群落影響最大的環(huán)境因子是pH值(r2=0.5651，P=0.0048)和有機(jī)質(zhì)OM(r2=0.4038，P=0.400)。

注：OM—有機(jī)質(zhì)；TN—全氮;AP—速效磷;AK—速效鉀；SWC—土壤含水率。下同。Note: OM-Organic matter; TN-Total N; AP-Available P; AK-Available K; SWC-Soil water content. The same below.圖9 Biolog-ECO與環(huán)境因子的RDA分析(箭頭代表環(huán)境因子)Fig.9 RDA analysis of Biolog-ECO and environmental factors (the arrow represents environmental factors)

2.3.2 土壤細(xì)菌在門水平下基于高通量的db-RDA分析 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌門水平的關(guān)系如圖10所示，不同處理的微生物群落分別聚集在不同位置，表明不同處理之間土壤微生物群落存在顯著差異。環(huán)境因子對不同施肥處理土壤微生物的影響不同。pH值與有機(jī)質(zhì)對土壤細(xì)菌群落的影響最大；速效磷、速效鉀、含水率、全氮與pH值之間的夾角為銳角，除速效磷之外其他環(huán)境因子與pH值之間的夾角為鈍角，說明這幾種環(huán)境因子之間是正相關(guān)關(guān)系；有機(jī)質(zhì)與pH值之間的夾角為鈍角，兩者之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；速效磷與有機(jī)質(zhì)之間呈正相關(guān)關(guān)系。其中速效鉀、含水率、全氮以及pH值與處理N和處理CK的土壤樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大的正相關(guān)性，而有機(jī)質(zhì)與處理G和處理M的土壤樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大的正相關(guān)性。

2.3.3 長期不同施肥條件下細(xì)菌門水平群落相對豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性 選取細(xì)菌門水平上豐度前10的物種，采用Spearman相關(guān)性系數(shù)，分析細(xì)菌種類與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。結(jié)果表明(圖11)，土壤速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)以及全氮的含量是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上最主要的環(huán)境因子。芽單胞菌門(Gemmatimonadota)和甲烷氧化菌門(Methylomirabilota)的群落相對豐度與有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷和速效鉀存在顯著負(fù)相關(guān)；厚壁菌門(Firmicutes)與有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀以及含水率存在顯著性正相關(guān)，酸桿菌門(Acidobacteriota)和甲烷氧化菌門(Methylomirabilota)與pH值存在顯著正相關(guān)。

注：X軸與Y軸分別為環(huán)境因子和不同物種，計(jì)算Spearman相關(guān)性系數(shù)R值和顯著性P值，R值在圖中用不同顏色顯示，而P值用星號顯示。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。Note: X-axis and Y-axis are environmental factors and different species respectively. Calculate Spearman correlation coefficient R value and significance P value. R value is displayed in different colors in the figure, while P value is displayed with asterisk. * represents P<0.05, ** represents P<0.01, *** represents P<0.001.圖11 細(xì)菌門水平與環(huán)境因子之間的相關(guān)性熱圖Fig.11 Heatmap of correlation between bacterial phylum />and environmental factors

3 討 論

微生物是土壤生態(tài)的重要組成部分，其活性與土壤肥力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)長期施用綠肥有效提高了土壤微生物的種類和數(shù)量，與多位學(xué)者的研究結(jié)果相似[23-26]。AWCD值反映微生物群落的代謝活性，是指示微生物分解代謝能力的重要指標(biāo)[27]。本研究表明，長期施用綠肥和農(nóng)家肥處理的AWCD值顯著高于其他施肥處理，施用綠肥以及農(nóng)家肥可以增加植物的凋落物和根系分泌物，補(bǔ)充土壤的有機(jī)質(zhì)，進(jìn)而提高土壤微生物的代謝活性[28-29]。

Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)是表征微生物功能多樣性的指標(biāo)[30]。長期施用綠肥和農(nóng)家肥可顯著提高土壤微生物群落多樣性。呂卓呈等[31]研究發(fā)現(xiàn)綠肥還田為土壤微生物提供了大量的碳源和氮源，能夠有效提高土壤微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。在本研究當(dāng)中，處理G在微平板培養(yǎng)168 h時(shí)Simpson指數(shù)較處理N顯著提高了0.21%，而Shannon指數(shù)兩者基本沒有差異，說明群落多樣性差異不大。Sun等[32]研究發(fā)現(xiàn)長期單施化肥會導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性降低，而李猛等[33]研究發(fā)現(xiàn)，長期單施氮肥會導(dǎo)致土壤中微生物的種類和數(shù)量減少，微生物整體代謝功能明顯下降，常見菌群的均勻度也低于其他處理。本研究中處理N與處理CK的3種指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù))結(jié)果相差不大，處理N的AWCD值均低于其他處理；處理G與處理N在McIntosh指數(shù)存在顯著性差異，前者較后者提高了18.46%，說明單施氮肥降低了土壤微生物活性及多樣性，且會導(dǎo)致菌群均勻度降低。通過對不同施肥條件下土壤微生物的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，處理N的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)一直低于其他4個(gè)處理的平均水平，這可能是由于農(nóng)家肥、綠肥施入帶來大量可被微生物利用的碳源和氮源，刺激了土壤微生物的生長；農(nóng)家肥的施入帶來大量的活性微生物，起到了“接種”的作用，促進(jìn)了微生物生長以及其活性增加[34]。綠肥在施入土壤后會被腐解，腐解過程中養(yǎng)分釋放速度較為緩慢，可以滿足作物長期生長過程中的養(yǎng)分需求，不僅能提高作物產(chǎn)量和養(yǎng)分利用率，還可以降低養(yǎng)分的淋溶損失[35]。羅希茜等[36]研究表明長期秸稈還田以及習(xí)慣施肥會導(dǎo)致微生物群落均勻度降低，與本研究處理S的McIntosh指數(shù)結(jié)果一致。通過微生物培養(yǎng)168 h碳源利用聚類分析熱圖來看，處理G的土壤微生物碳源代謝能力最高，且對酸類碳源的利用率明顯高于其他處理；通過聚類分析可以看出一些酸類、氨基酸類以及單糖/糖苷/聚合糖類碳源在5種不同處理下土壤微生物利用率較高；而各處理均對a-丁酮酸、D,L-a-甘油、甘氨酰-L-谷氨酸利用率較差。

從細(xì)菌群落門水平上的分布來看，長期施用綠肥與其他施肥條件的土壤細(xì)菌群落組成一致，但是各門類細(xì)菌的豐度大小存在差異。李秀英等[37]研究表明，長期單施化肥會導(dǎo)致土壤細(xì)菌數(shù)量低于荒地，如土壤固氮菌、反硝化細(xì)菌、纖維分解菌等，而土壤放線菌和硝化細(xì)菌會增加。本研究中，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門在各個(gè)土壤樣本中均大量存在，為土壤優(yōu)勢菌群；處理G放線菌門豐度最高，占29.94%，且處理G相比處理N放線菌門豐度提高了16.86%。呂卓呈等[31]研究表明長期施用綠肥可以有效提高土壤細(xì)菌OTU數(shù)量；與其他施肥條件相比，處理G土壤樣本中的放線菌門豐度提高7.01%，細(xì)菌的OTU數(shù)量相比施用化肥處理提高了1.92%。鄒湘等[38]研究表明不施肥與化肥配施豬糞的土壤細(xì)菌群落聚類更接近，本研究也發(fā)現(xiàn)單施化肥與不施肥的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似；韓梅等[39]研究表明，長期化肥、綠肥配施提高了土壤微生物群落的穩(wěn)定性，并且使得變形菌門與酸桿菌門成為優(yōu)勢菌種；變形菌門是一種在土壤中大量存在的富營養(yǎng)微生物，很多種類的變形菌都可以在土壤中起固氮作用[40]。本研究各施肥處理的土壤中變形菌門種類豐度均高于不施肥對照，說明長期施肥有利于土壤固氮以及土壤微生物群落的穩(wěn)定。宋兆齊等[41]研究表明厚壁菌門有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，能夠降解土壤中一些難溶化合物，并且可以有效防治一些植物病蟲害，在土壤生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要作用；長期施用農(nóng)家肥和綠肥的土壤樣本中，厚壁菌門分別占總豐富度的12.98%和7.29%。長期施用綠肥能有效提高土壤質(zhì)量以及土壤肥力。酸桿菌門在土壤生態(tài)系統(tǒng)中有著重要的作用。本研究表明，施綠肥和施農(nóng)家肥的土壤中酸桿菌門的豐度低于其他施肥條件下的土壤，且土壤168 h熱圖中綠肥處理明顯提高了酸類碳源的利用率，這可能是由于綠肥與農(nóng)家肥中某些物質(zhì)增加了土壤堿性，或者是施用綠肥導(dǎo)致酸類碳源被其他微生物大量利用而影響了酸桿菌門的生長發(fā)育，導(dǎo)致其豐度降低。細(xì)菌群落在屬水平上的Heatmap圖(圖7)表明，不同處理土壤細(xì)菌群落在屬水平上組成基本一致。芽孢桿菌是一種具有解磷、解鉀、固氮等生物活性的微生物，有利于提高作物產(chǎn)量，且芽孢桿菌抗逆性好。在李彥林等[42]的研究中，耕地中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、假節(jié)桿菌屬等，耕地微生物數(shù)量大于其他類型土壤微生物數(shù)量。趙冬雪[43]研究表明長期施用綠肥會導(dǎo)致土壤中芽孢桿菌屬水平提高；本研究表明長期施用綠肥有效增加了芽孢桿菌的豐度，比單施氮肥處理提高了126.06%，與其研究結(jié)果一致。這可能是由于綠肥翻壓還田后增加了土壤中的磷、氮等元素含量，進(jìn)而提高了芽孢桿菌的豐度。長期施用綠肥有效提高了假節(jié)桿菌屬的含量，比單施氮肥處理提高了317.12%，假節(jié)桿菌屬有利于有機(jī)物的降解，提高了土壤養(yǎng)分含量以及土壤肥力?？傮w來看，長期施用綠肥有效提高了土壤中有益菌的含量，從而提高了土壤肥力，有利于作物的生長。

對Biolog-ECO檢測以及高通量測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行RDA相關(guān)性及相關(guān)性熱圖分析，可以看出，pH值與有機(jī)質(zhì)是影響土壤微生物群落多樣性的最主要環(huán)境因素；土壤全氮、pH值、土壤速效鉀以及含水率之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而綠肥主要為豆科作物，能大量固定空氣中的氮，通過其翻壓還田，可有效增加土壤氮含量。氮素的增加可以極顯著地提高土壤速效磷、速效鉀含量以及土壤含水率，有利于土壤肥力的增加。Biolog-ECO[30]和高通量測序方法對微生物群落多樣性分析的側(cè)重點(diǎn)不同，Biolog-ECO主要分析微生物的代謝活性，而高通量測序主要分析土壤中所有微生物基因的多樣性。本研究結(jié)果表明綠肥以及農(nóng)家肥有利于土壤肥力的提高，兩種方法相互印證，如Biolog-ECO分析得出施綠肥使得酸類碳源的利用率較高，而高通量測序結(jié)果分析得出施用綠肥導(dǎo)致酸桿菌門相對豐度降低。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度與有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀含量及pH等土壤理化因子均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，這些理化因子的改變對微生物群落變化有明顯影響[44]。

4 結(jié) 論

1)長期施用綠肥有利于提高土壤微生物群落的多樣性，單施氮肥降低了土壤微生物的多樣性，綠肥處理相比氮肥處理的McIntosh指數(shù)提高了18.46%。

2)單施氮肥降低了土壤微生物對單糖/糖苷/聚合糖類的代謝能力，長期施用綠肥可以增強(qiáng)土壤微生物對碳源的代謝能力，且顯著提高了對酸類碳源的利用，降低了土壤中酸桿菌門的豐度。

3)與單施氮肥相比，長期施用綠肥土壤中放線菌門的豐度提高了16.86%，芽孢桿菌屬、厚壁菌門、鏈霉菌屬的相對豐度也有所提高，從而提升了土壤抵御土傳病害的能力。