優(yōu)良生防枯草芽孢桿菌CY1固態(tài)發(fā)酵研制生物有機(jī)肥工藝參數(shù)優(yōu)化

李彬濤，韋小敏，來航線，李玉龍，王旭東

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

固態(tài)發(fā)酵具有能耗低、環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)，能使微生物保持原始的自然生長狀態(tài)，有利于發(fā)酵代謝產(chǎn)物的積累[1]。伴隨著新型功能菌株的篩選鑒定及作用機(jī)制的研究，枯草芽孢桿菌以其自身綠色環(huán)保且作用效果良好的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被廣泛研究推廣[2]。枯草芽孢桿菌CY1(BacillussubtilisCY1)能夠通過分泌胞外酶等促進(jìn)植物根系生長的物質(zhì)，提高植物利用養(yǎng)分的能力，對(duì)番茄植株生長具有促進(jìn)作用，同時(shí)可以通過提高植物體內(nèi)防御酶活性增強(qiáng)植物對(duì)病原入侵的抵抗能力，兼具生物防治及促生效果[6]，可被用作固態(tài)發(fā)酵的接種劑制備功能型生物有機(jī)肥[3]。然而，目前生物有機(jī)肥的生產(chǎn)主要采用有益微生物與有機(jī)肥混合的方式進(jìn)行，存在功能菌存活率低、產(chǎn)品質(zhì)量不達(dá)標(biāo)等問題，造成功能菌的浪費(fèi)以及生產(chǎn)成本的增加[4]。2019年全國微生物肥料質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，約78%的微生物肥料因產(chǎn)品有效活菌數(shù)含量較低而不合格。菌種能否在基質(zhì)中存活取決于其生長環(huán)境，與碳氮比、pH、含水量及生長因子密切相關(guān)[5]，然而目前此方面缺乏系統(tǒng)研究。因此，如何通過工藝參數(shù)優(yōu)化實(shí)現(xiàn)功能益生菌的擴(kuò)繁至關(guān)重要。

本研究通過固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，選取前期經(jīng)過篩選鑒定得到的一株生防效果較好的枯草芽孢桿菌CY1為固態(tài)發(fā)酵功能菌劑[6]，結(jié)合原料成本及產(chǎn)品質(zhì)量，以腐熟豬糞堆肥為發(fā)酵原料，麩皮、豆粕、玉米粉為發(fā)酵輔料，有效活菌數(shù)為觀測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡法及響應(yīng)面分析，優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝條件，為固態(tài)發(fā)酵制備生物有機(jī)肥提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)我國北方地區(qū)糧油副產(chǎn)物的綜合利用和資源開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：生防枯草芽孢桿菌CY1，由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院資源環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保藏。

發(fā)酵原料：腐熟豬糞基質(zhì)，pH 8.21，含水量11.74%，有機(jī)質(zhì)含量254.71 g·kg-1，總氮含量13.40 g·kg-1。

發(fā)酵輔料：麩皮、豆粕、玉米粉，購置于陜西省楊凌農(nóng)業(yè)高新產(chǎn)業(yè)示范區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。其中，麩皮pH 9.30，含水量1.32%，有機(jī)質(zhì)含量407.28 g·kg-1，總氮含量27.66 g·kg-1；豆粕pH 4.95，含水量1.95%，有機(jī)質(zhì)含量448.80 g·kg-1，總氮含量81.21 g·kg-1；米粉pH 8.79，含水量2.12%，有機(jī)質(zhì)含量404.26 g·kg-1，總氮含量55.37 g·kg-1。

種子培養(yǎng)基(LA液體培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，pH 7.2，121℃滅菌30 min。

固體活化培養(yǎng)基(LA固體培養(yǎng)基)：在LA液體培養(yǎng)基中加入15 g·L-1瓊脂粉。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn) 選取發(fā)酵輔料配比、原料輔料配比、接種量3個(gè)因素進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)。輔料配比設(shè)置14∶1∶5、15∶1∶4、16∶1∶3、17∶1∶2、18∶1∶1共5個(gè)水平，原料輔料配比設(shè)置7∶3、8∶2、9∶1共3個(gè)水平，接種量設(shè)置1%、5%、10%、15%(mL·g-1)共4個(gè)水平，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。調(diào)節(jié)初始含水量為30%，在37℃條件下培養(yǎng)7 d，分別取第3天及第7天樣測(cè)定CY1有效活菌數(shù)。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn) 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)(A：初始pH；B：KH2PO4含量；C：MgSO4含量；D：空列項(xiàng)；E：MnSO4含量；F：發(fā)酵溫度；G：空列項(xiàng)；H：葡萄糖含量；I：(NH4)2SO4含量；J：空列項(xiàng)；K：含水量)，選取8個(gè)影響活菌數(shù)的主要因素，每個(gè)因素取高、低2個(gè)水平，其余3個(gè)因素為虛擬變量，用于誤差估計(jì)(表1)[7]。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)及方差分析結(jié)果，篩選主要影響因素設(shè)計(jì)爬坡方向和步長，確定最陡上升路徑[8]。以活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最大響應(yīng)區(qū)域，其余不顯著因素取中間值。

1.2.4 響應(yīng)面(RSM)試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，顯著因素的零水平取上述得到的中心點(diǎn)數(shù)值，高水平和低水平分別高于或低于零水平1個(gè)實(shí)際步長[9]。以初始pH、發(fā)酵溫度以及含水量為自變量，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 研究方法

1.3.1 種子液的制備 將菌株CY1在固體活化培養(yǎng)基平板上于37℃培養(yǎng)箱中活化36 h，挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基，37℃、180 r·min-1培養(yǎng)20 h作為種子液，有效活菌數(shù)約為1.0×108CFU·mL-1。

1.3.2 活菌計(jì)數(shù)方法 稱取5 g發(fā)酵原料于含有45 mL無菌水的三角瓶中，加入適量小玻璃珠，30℃、180 r·min-1振蕩30 min，制得1∶10稀釋液。吸取1 mL稀釋液注入含有9 mL無菌水的離心管中，振蕩混勻，得到1∶100稀釋液。依次類推制成不同梯度10倍遞增稀釋液。采用涂布法進(jìn)行接種，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出計(jì)有效活菌數(shù)(CFU·g-1，干重)[10-11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值表示。采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，采用Design Expert 9.0.2軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素條件下有效活菌數(shù)的變化特征

根據(jù)發(fā)酵輔料碳氮比，設(shè)置5個(gè)麩皮、豆粕、玉米粉配比水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)(圖1A)。第3天時(shí)，各配比之間沒有顯著性差異。第7天時(shí)，隨著麩皮添加量的增大，有效活菌數(shù)先增加后下降，主要原因是麩皮具有更高的孔隙度，為微生物的生長繁殖提供充足的氧氣，當(dāng)輔料配比達(dá)到15∶1∶4這個(gè)閾值時(shí)，碳源作為主要的影響因素，粒徑較小的玉米粉更有利于微生物的分解利用。因此，確定發(fā)酵輔料的配比為15∶1∶4。

以腐熟豬糞為發(fā)酵原料，麩皮、豆粕、玉米粉為發(fā)酵輔料，通過單因素試驗(yàn)獲得最佳原料、輔料配比(圖1B)。第3天時(shí)，不同處理間存在顯著性差異，隨著原料添加量的增加，有效活菌數(shù)逐漸下降。第7天時(shí)，原料∶輔料為8∶2的條件下活菌數(shù)達(dá)到7.8×109CFU·g-1，顯著高于其他處理。因此，確定發(fā)酵原料輔料配比為8∶2。

接種量作為發(fā)酵的重要因素直接影響著發(fā)酵產(chǎn)物的有效活菌數(shù)(圖1C)。處理間在第3天和第7天均存在顯著性差異，有效活菌數(shù)隨著接種量的增加而增加。與第3天相比，第7天的有效活菌數(shù)在1%、5%、10%和15%的接種量下分別提高了10.88、12.10、11.42倍及9.05倍。然而，更大的接種量意味著更高昂的生產(chǎn)成本，因此，確定固態(tài)發(fā)酵初始接種量為5%。

注：小寫字母表示在同一時(shí)間下不同處理的差異顯著性(P<0.05)。Note: Lower case letters indicate the significant difference between treatments at the same time (P<0.05).圖1 固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results of solid fermentation

2.2 有效活菌數(shù)關(guān)鍵影響因素的確定

如表2、表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析所示， KH2PO4含量、MgSO4含量、MnSO4含量、發(fā)酵溫度、葡萄糖含量及含水量對(duì)有效活菌數(shù)的影響效應(yīng)值為正；初始pH及(NH4)2SO4含量對(duì)有效活菌數(shù)的影響效應(yīng)值為負(fù)。主效應(yīng)P=0.0453(P<0.05)、R2為0.9621，表明該回歸模型顯著，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素在所選取的水平范圍內(nèi)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有效活菌數(shù)的影響較顯著，其中，初始pH、發(fā)酵溫度、含水量可信度大于95%(P<0.05)，是影響有效活菌數(shù)的顯著因素。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Plackett-Burman experiment design

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析Table 3 Results of variance analysis of Plackett-Burman experiment

2.3 有效活菌數(shù)對(duì)關(guān)鍵影響因素的響應(yīng)及模型的構(gòu)建

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)初始pH、發(fā)酵溫度、含水量3個(gè)顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其余因素取中間值(表4)。結(jié)果表明，初始pH為7.5、發(fā)酵溫度為36℃、含水量為26%時(shí)有效活菌數(shù)最大，達(dá)到3.91×1010CFU·g-1。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Results of steepest ascent test

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心點(diǎn)，以初始pH(A)、發(fā)酵溫度(B)、含水量(C)為自變量，活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，采用Box-benhnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表5)，通過方差分析統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確定最優(yōu)組合(表6)。經(jīng)過回歸擬合后，得到回歸方程：

表5 Box-benhnken試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of Box-benhnken experiment design

Y=4.66+0.0637A+0.1375B+0.2012C+0.1625AB-0.2500AC-0.3325BC-1.09A2-0.8885B2-0.5610C2

各因素對(duì)有效活菌數(shù)(Y)影響的順序?yàn)楹?發(fā)酵溫度>初始pH。由表6可得，方程模型回歸擬合顯著(P<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，其中，一次項(xiàng)C顯著、二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著、交互項(xiàng)BC顯著。該二次多項(xiàng)回歸方程決定系數(shù)R2為0.9681，表明自變量與因變量具有較強(qiáng)的線性關(guān)系，該方程較好地描述了各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可用于確定固態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件。

表6 Box-benhnken試驗(yàn)方差分析Table 6 The results of variance analysis of Box-benhnken experiment

2.4 響應(yīng)面分析

由圖2可得，有效活菌數(shù)隨著初始pH、發(fā)酵溫度及含水量的增大均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，該響應(yīng)曲面存在最優(yōu)范圍。當(dāng)固態(tài)發(fā)酵條件為初始pH 7.507、發(fā)酵溫度36.097℃、含水量26.325%時(shí)，有效活菌數(shù)檢出量最大，預(yù)測(cè)值為4.682×1010CFU·g-1。在初始pH 7.51、發(fā)酵溫度36.10℃、含水量26.33%的最佳發(fā)酵條件調(diào)整值下實(shí)際菌體數(shù)量為4.57×1010CFU·g-1，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近。此外，響應(yīng)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.45%，在可允許誤差5%的范圍之內(nèi)，證實(shí)了該模型的有效性。因此，該響應(yīng)模型對(duì)于固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化可行，此試驗(yàn)方法具有較高的準(zhǔn)確性，通過該方法，可獲得具有較高有效活菌數(shù)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。

圖2 初始pH、發(fā)酵溫度、含水量交互影響有效活菌數(shù)的響應(yīng)面Fig.2 Initial pH, fermentation temperature and water content interacted on the response surface of effective viable bacteria count

3 討 論

近年來隨著枯草芽孢桿菌功能的研究，其作為廣譜性的優(yōu)良菌種得到越來越廣泛的應(yīng)用[12]，常常被當(dāng)作有益微生物添加劑制備生物有機(jī)肥[13-14]。孫一凡等[6]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌CY1具有促進(jìn)番茄生長、增強(qiáng)植株抗病性的能力，是一株良好的生防菌種。本研究在此基礎(chǔ)上，以該生防枯草芽孢桿菌CY1為接種菌劑，通過固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化，旨在研制出一種具有生防作用的新型生物有機(jī)肥。

采用固態(tài)發(fā)酵的方法，在經(jīng)過腐熟的有機(jī)物料中加入功能菌制備生物有機(jī)肥可有效減小土著雜菌對(duì)功能菌的影響[15]。碳氮比是影響固態(tài)發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵因素，碳氮比過高時(shí)微生物由于氮不足生長會(huì)受到限制，碳氮比過低時(shí)發(fā)酵過程容易產(chǎn)生氨，過量的氨會(huì)抑制微生物的生長。本研究結(jié)果表明發(fā)酵原料、輔料質(zhì)量比為8∶2，其中輔料麩皮、豆粕、玉米粉的質(zhì)量比為15∶1∶4時(shí)有效活菌數(shù)含量最大。根據(jù)原料基礎(chǔ)理化性質(zhì)，該條件下碳氮比約為19。大量研究對(duì)有機(jī)物料高溫堆肥的條件進(jìn)行了探討，并得到了與之相似的結(jié)論，認(rèn)為碳氮比為20～30[16]、pH為5.5～8.0[17]時(shí)有利于微生物菌劑促進(jìn)有機(jī)物料的分解，提高堆肥腐熟度。因此，該營養(yǎng)條件有利于發(fā)酵功能菌的擴(kuò)繁及生物有機(jī)肥有效活菌數(shù)的提高。接種量是影響固態(tài)發(fā)酵的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，接種量大可以有效提高菌體的繁殖速度，然而過大的接種量會(huì)造成菌種資源的浪費(fèi)，接種量太小則會(huì)使發(fā)酵周期延長，增大污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，探索并且掌握適宜的接種量是保證發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵初始接種量為5%時(shí)菌種的擴(kuò)繁效率最高，且發(fā)酵產(chǎn)物有效活菌數(shù)含量較高、成本較低。

本研究中PB試驗(yàn)結(jié)果表明溫度、pH、含水量顯著影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量；主要是由于在微生物的生長過程中，蛋白質(zhì)的合成酶、細(xì)胞的活性以及代謝產(chǎn)物的合成對(duì)溫度敏感[18]。此外，不同微生物本身的固有特性不同，生長發(fā)育對(duì)環(huán)境pH的要求也不同。本研究與前人的研究結(jié)果一致，即細(xì)菌在中性條件下生長較好[19]。黃小琴等[20]研究表明，麩皮、豆粕等比例混合為最佳發(fā)酵基質(zhì)，添加5%蔗糖及5%酵母粉，在pH值7.5、發(fā)酵溫度32℃下枯草芽孢桿菌Bs2004菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物含菌量達(dá)到9.62×109CFU·g-1。本研究通過工藝條件優(yōu)化后，在初始pH 7.51、發(fā)酵溫度36.10℃、含水量26.33%時(shí)，有效活菌數(shù)可達(dá)到4.57×1010CFU·g-1。

4 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為：初始pH 7.51、KH2PO4含量0.75%、MgSO4含量0.15%、MnSO4含量0.15%、發(fā)酵溫度36.10℃、葡萄糖含量6.00%、(NH4)2SO4含量0.75%、含水量26.33%，此時(shí)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物有效活菌數(shù)最大，為4.57×1010CFU·g-1。該結(jié)果為提高糧油加工副產(chǎn)物麩皮、豆粕、玉米粉的附加值，制備高效、廉價(jià)的枯草芽孢桿菌生物有機(jī)肥提供參考依據(jù)。