基于轉(zhuǎn)錄組的小豆SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用

徐曉丹, 冷 淼, 張明媛, 柯希望, 殷麗華, 左豫虎

(黑龍江省作物-有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319)

小豆[Vignaangularis(Willd.) Ohwi & Ohashi]，俗名紅小豆、赤豆等，是一種重要的食用豆類作物，起源于我國(guó)，主要種植于中國(guó)、朝鮮和日本。近年來(lái)，小豆的種質(zhì)資源鑒定和育種研究工作獲得了一定的成果，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，1969—2019年，我國(guó)小豆育成品種共137份；然而與保存的超過(guò)5000份的小豆種質(zhì)資源相較，我國(guó)的小豆種質(zhì)資源尚未得到充分利用[1]。小豆育種工作相對(duì)滯后，究其原因是小豆基礎(chǔ)研究不足，特別是分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用不夠深入，因此，加強(qiáng)小豆基礎(chǔ)研究，建立小豆DNA分子數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘其育種潛力，是當(dāng)前深入推進(jìn)小豆育種工作的一個(gè)有效途徑。

分子標(biāo)記是鑒定種質(zhì)資源和分子標(biāo)記輔助育種的重要手段，而開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記是小豆種質(zhì)資源鑒定、創(chuàng)新和合理利用的第一步。在基于DNA的分子標(biāo)記中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR)是一類由一定重復(fù)數(shù)目的重復(fù)單元(一般為1～6個(gè)堿基)組成的串聯(lián)重復(fù)序列，這種標(biāo)記廣泛存在于動(dòng)植物基因組中。相對(duì)于其他分子標(biāo)記，SSR分子標(biāo)記具有位點(diǎn)特異、復(fù)等位、共顯性和分布廣的優(yōu)點(diǎn)，在許多作物的遺傳多樣性研究、品種鑒定、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種工作中應(yīng)用廣泛[2-5]。然而，SSR分子標(biāo)記在小豆研究上的應(yīng)用較少，只在遺傳多樣性和基因定位方面有少量應(yīng)用[6-11]。

SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于小豆研究的前提是開(kāi)發(fā)大量的小豆SSR分子標(biāo)記。而利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以獲得大量序列信息用于分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)。這一技術(shù)已經(jīng)在糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物中得到成熟運(yùn)用[12-14]，但在小豆及其近緣種作物上的應(yīng)用卻較少。例如，Verma等[15]利用轉(zhuǎn)錄組序列在兵豆(LensculinarisMedik.)上開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記，并利用開(kāi)發(fā)的標(biāo)記分析了兵豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性；Raizada等[16]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了黑吉豆(Vignamungovar. silvestris)的SSR分子標(biāo)記。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，小豆基因組已被破譯[17]，因此，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)小豆SSR分子標(biāo)記更具可行性。

本研究以小豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，鑒定小豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的SSR分子標(biāo)記，從而了解小豆轉(zhuǎn)錄組的SSR特性。在此基礎(chǔ)上，從開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記中，選擇部分標(biāo)記對(duì)小豆資源進(jìn)行聚類分析，為小豆種質(zhì)鑒定和資源合理利用奠定分子基礎(chǔ)。同時(shí)，也可為小豆分子標(biāo)記輔助育種提供更豐富的標(biāo)記來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小豆種質(zhì)資源36份，其中小豆種質(zhì)‘QH1’用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。所有小豆種質(zhì)資源均保存于國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，來(lái)源信息詳見(jiàn)表1。

表1 供試小豆種質(zhì)資源Table 1 Adzuki bean varieties for testing

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及SSR位點(diǎn)分析

在小豆資源‘QH1’單葉完全展開(kāi)后，取葉片組織用于提取RNA，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(北京諾禾致源科技股份有限公司)。對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene進(jìn)行過(guò)濾，去掉小片段。利用軟件Primer 3.0搜索過(guò)濾后序列的SSR位點(diǎn)，并根據(jù)搜索出的SSR位點(diǎn)及其側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.3 小豆基因組DNA提取

將用于小豆遺傳背景分析的種質(zhì)材料種植在直徑18 cm的花盆中，當(dāng)小豆植株單葉完全展開(kāi)時(shí)取葉片組織。每個(gè)品種在5株植株上各取1片葉子用于提取小豆基因組DNA。DNA提取參照CTAB法，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)小豆基因組DNA的提取質(zhì)量。

1.4 小豆SSR分子標(biāo)記檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記的有效性，從小豆每條染色體上均勻隨機(jī)選取12個(gè)標(biāo)記，總計(jì)132個(gè)SSR分子標(biāo)記，合成引物。PCR反應(yīng)體系為10 μL，DNA模板1 μL(80 ng)，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Taq PCRMasterMix 5 μl，補(bǔ)雙蒸水至總體積10 μL。PCR反應(yīng)程序，95℃，預(yù)變性5 mins；95℃，變性30 s，57℃，退火30 s，72℃，復(fù)性45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，延伸10 mins。PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合，利用DYCZ-30C雙板夾芯式垂直電泳儀(北京六一儀器廠)在8%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳后銀染顯影，拍照記錄帶型。

1.5 小豆種質(zhì)資源的聚類分析

以36份小豆種質(zhì)的DNA為模板，檢測(cè)多態(tài)性SSR標(biāo)記的帶型。對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，記錄每個(gè)位點(diǎn)的等位基因情況，記錄基因型。利用軟件Popgen 32和MEGA 7.0.14繪制進(jìn)化樹(shù)，分析小豆種質(zhì)資源的遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記類型特征及分布特點(diǎn)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾獲得37 362 760 bp數(shù)據(jù)，包括26 857個(gè)reads。SSR位點(diǎn)搜索，共檢測(cè)到3 045個(gè)SSR標(biāo)記。SSR標(biāo)記的重復(fù)單元堿基數(shù)1～6所對(duì)應(yīng)的標(biāo)記數(shù)目分別為1256、803、779、32、9和14個(gè)，另外，還有152個(gè)標(biāo)記的重復(fù)單元為不同重復(fù)的組合(圖1,見(jiàn)17頁(yè))。從不同重復(fù)單元的SSR標(biāo)記數(shù)量分布可以看出，小豆轉(zhuǎn)錄組的SSR標(biāo)記主要重復(fù)單元為1～3個(gè)堿基，包括41.2%的單核苷酸重復(fù)、26.4%的二核苷酸重復(fù)和25.6%的三核苷酸重復(fù)，三者占比93.2%。

圖1 不同重復(fù)單元的SSR標(biāo)記的數(shù)量分布Fig.1 The number distribution of SSR markers with different repeat motif

將挖掘的3 045個(gè)SSR分子標(biāo)記與小豆參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001723775.1)比對(duì)，1 986個(gè)標(biāo)記(65.2%)可以錨定到小豆染色體上，這些錨定到染色體上的標(biāo)記中，1 505個(gè)標(biāo)記可成功設(shè)計(jì)引物。根據(jù)這1 505個(gè)標(biāo)記的基因組位置信息，構(gòu)建了包括1 505個(gè)SSR分子標(biāo)記的小豆物理圖譜。

構(gòu)建的物理圖譜的標(biāo)記間平均物理距離為300 kb，各染色體上SSR分子標(biāo)記的分布數(shù)量為56～244個(gè)，平均每條染色體分布標(biāo)記數(shù)量為137個(gè)，其中，6號(hào)染色體標(biāo)記數(shù)量最多，8號(hào)染色體標(biāo)記分布數(shù)量最少。各染色體上的SSR標(biāo)記數(shù)量分布雖然差別較大，但標(biāo)記數(shù)量與染色體大小的變化曲線較為一致(圖2)，說(shuō)明構(gòu)建的SSR分子標(biāo)記物理圖譜的標(biāo)記分布較為均勻，各染色體上SSR標(biāo)記數(shù)量的多少和染色體大小有關(guān)。

圖2 SSR標(biāo)記在染色體上的分布Fig.2 Distribution of SSR markers on chromosomes

2.2 SSR標(biāo)記的有效性檢驗(yàn)

從構(gòu)建的SSR分子標(biāo)記的物理圖譜中，每條染色體隨機(jī)選取12個(gè)SSR分子標(biāo)記，總計(jì)132個(gè)標(biāo)記，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成標(biāo)記的擴(kuò)增引物。引物合成后，以小豆資源“QH1”的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，發(fā)現(xiàn)共有118對(duì)引物可擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物(圖3)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100～279 bp，引物擴(kuò)增的有效率為89.4%。

圖3 132個(gè)SSR分子標(biāo)記的有效性檢驗(yàn)(數(shù)字為標(biāo)記編號(hào))Fig.3 Validity of 132 SSR molecular markers (number refers to the number of markers)

2.3 小豆種質(zhì)資源的聚類分析

為了驗(yàn)證開(kāi)發(fā)的小豆SSR分子標(biāo)記是否可以應(yīng)用于小豆種質(zhì)資源背景分析，經(jīng)多態(tài)性篩選，獲得6個(gè)具有多態(tài)性的小豆SSR分子標(biāo)記，包括標(biāo)記ByauVa0261、ByauVa0277、ByauVa0300、ByauVa0303、ByauVa0451和ByauVa1454(表2)，可以用于小豆種質(zhì)資源的遺傳背景分析。

表2 6個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記的引物Table 2 Primers for 6 polymorphic SSR markers

將6個(gè)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在36份小豆品種上進(jìn)行分型(圖4)，檢測(cè)到有效等位變異數(shù)為2～4個(gè)。利用軟件Popgen32，構(gòu)建小豆種質(zhì)資源的進(jìn)化樹(shù)(圖5)，可以將供試小豆材料分為4組。Group 1包括13份小豆資源，其中，TL01、LZX066、QH5、LJ02、LJ03、GN01、GN02、紅豆 XD04-09、品紅23129-1和GN03共10份資源的分型結(jié)果完全一致，說(shuō)明這些小豆資源的遺傳背景較為相近。Group 2包括18份小豆資源，其中，吉林373、保876-16、QH1、寶清紅和龍小豆2號(hào)分型一致，紅豆 XD04-07、TL04和QH4分型一致，TL03和TL05分型一致，其余小豆資源間均有一定的分型差異。Group 3有4份小豆資源，包括QH6、保876-16(2)、小豐2號(hào)和極旱紅小豆，資源間具有一定分型差異。Group 4包括1份小豆資源北6 JN003，該資源與其他資源遺傳差異較大。

圖4 6個(gè)SSR標(biāo)記在36個(gè)小豆資源上的分型(左邊為標(biāo)記名稱，紅色箭頭表示等位基因)Fig.4 Genotyping of six SSR markers on 36 adzuki bean varieties (label name on the left, alleles indicated by red arrows)

圖5 36份小豆資源的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of 36 adzuki bean varieties

3 討 論

SSR分子標(biāo)記在作物種質(zhì)資源分析、基因定位等研究中應(yīng)用較為廣泛。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比基因組測(cè)序成本低，因此許多植物通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了大量SSR分子標(biāo)記。在豇豆屬植物中，飯豆(VignaumbellataL.)、綠豆(VignaradiateL.)、黑豆[Vignamungo(L.) Hepper]以及小豆，都通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記[18-21]。Chen等[18]利用小豆轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)了7 947個(gè)SSR分子標(biāo)記，其主要重復(fù)單元為單核苷酸、兩核苷酸和三核苷酸重復(fù)。本研究利小豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了3 045個(gè)SSR分子標(biāo)記，同樣發(fā)現(xiàn)，小豆轉(zhuǎn)錄組水平獲得的SSR分子標(biāo)記的重復(fù)基序也為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，分別占SSR標(biāo)記總數(shù)的41.2%、26.4%和25.6%。此外，QH1是一個(gè)較優(yōu)秀的小豆抗銹病資源，利用該資源的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記可以用于該資源的抗銹病基因挖掘。

研究利用1 505個(gè)可以錨定至染色體上并且能夠設(shè)計(jì)引物的標(biāo)記構(gòu)建了較高密度的小豆SSR分子標(biāo)記物理圖譜，豐富了小豆SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。為了檢驗(yàn)SSR分子標(biāo)記的有效性，隨機(jī)從小豆的11條染色體上選擇132個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)118個(gè)標(biāo)記(89.4%)可以有效擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物。這些標(biāo)記將為小豆的種質(zhì)資源鑒定、遺傳背景研究以及優(yōu)良性狀基因定位提供技術(shù)支撐。經(jīng)過(guò)多態(tài)性篩選，獲得6個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，利用其分析36份小豆種質(zhì)資源的遺傳背景，可以將小豆資源分為4個(gè)類群，說(shuō)明這16個(gè)標(biāo)記可以用于小豆的資源鑒定。

小豆種質(zhì)資源分析中發(fā)現(xiàn)，Group 1包括13份資源，10份來(lái)源于黑龍江省，3份來(lái)源于遼寧省，說(shuō)明這一組的小豆資源以黑龍江省內(nèi)小豆資源為主，與遼寧省的小豆資源有少量交流；Group 2包括18份資源，10份來(lái)源于黑龍江省，8份來(lái)源于遼寧省，說(shuō)明這一組2個(gè)省份的小豆資源存在較廣泛的交流；Group 3的4份資源和Group 4的1份資源基因型較其他資源差異較大，說(shuō)明這些資源的遺傳背景具有一定的獨(dú)特性。

聚類分析發(fā)現(xiàn)小豆種質(zhì)存在基因型相同名稱不同的情況，Group 1中有10份品種，包括TL01、LZX066、QH5、LJ02、LJ03、GN01、GN02、紅豆 XD04-09、品紅23129-1和GN03，它們的分型結(jié)果一致；Group 2中，吉林373、保876-16、QH1、寶清紅和龍小豆2號(hào)分型一致，紅豆 XD04-07、TL04和QH4分型一致，“TL03”和“TL05”分型一致。這種結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是多態(tài)性標(biāo)記的數(shù)量較少，對(duì)于遺傳差異較小的種質(zhì)，研究中使用的6個(gè)標(biāo)記不足以完全區(qū)分。因此，有必要利用更多標(biāo)記，加強(qiáng)小豆種質(zhì)資源遺傳背景研究，梳理小豆種質(zhì)資源情況，以加快小豆種質(zhì)創(chuàng)建過(guò)程。