基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討土荊皮治療淺部真菌病的作用機(jī)制

袁芳草，吳 然，李 倩，張丹林，彭 超，唐姍姍

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽(yáng) 550001）

淺部真菌?。⊿uperficial mycosis）是一種真菌疾病，其病灶主要局限于皮膚、指甲或頭發(fā)的外層，但可能會(huì)侵入更深層的組織[1]。此病由皮膚癬菌、霉菌、酵母菌和酵母樣真菌引起，會(huì)對(duì)患者的心理和社會(huì)心理因素產(chǎn)生負(fù)面影響，并降低其生活質(zhì)量，是全世界重點(diǎn)關(guān)注的健康問(wèn)題[2]。目前由于抗真菌藥物在淺部真菌病治療中的廣泛應(yīng)用，有關(guān)抗真菌藥物耐藥性的報(bào)道不斷增加，抗真菌藥物耐藥性的增加正在成為一個(gè)公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[3]。中醫(yī)藥治療淺部真菌病歷史悠久，中藥外治淺部真菌病的療效可與西醫(yī)抗真菌藥媲美，且具有不良反應(yīng)少和復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢(shì)[4]。土荊皮（Pseudolarix kamepferi）又名土槿皮，為我國(guó)特有松科植物金錢(qián)松的干燥根皮或近根樹(shù)皮，始載于趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，具有殺蟲(chóng)止癢、祛風(fēng)除濕的功效[5]。土荊皮的多種化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗血管生成、抗真菌等活性[6]，其中抗真菌活性應(yīng)用前景廣闊，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)對(duì)土荊皮治療淺部真菌病的效果進(jìn)行研究，旨在為淺部真菌病的中藥治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種和藥物

紅色毛癬菌由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科饋贈(zèng)；土荊皮飲片購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.2 試劑和儀器

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；氯霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)致微ZWALWAY 產(chǎn)品）；顯微鏡（瑞士TECAN 公司產(chǎn)品）；麥?zhǔn)媳葷醿x（北京海富達(dá)科技有限公司產(chǎn)品）；玻璃冷凝管回流裝置（山東禹王公司產(chǎn)品）；真空干燥箱（天津鑫州儀器有限公司產(chǎn)品）。

1.3 土荊皮成分和靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)輸入土荊皮作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將OB 值≥30% 和DL 值≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將篩選出的有效成分上傳至PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到對(duì)應(yīng)的SMILES 號(hào)，隨后通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將得出的所有靶點(diǎn)進(jìn)行去重整理，并通過(guò)Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)

將Superficial mycosis 作 為 關(guān) 鍵 詞，通 過(guò)GeneCards 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，即得出淺部真菌病的靶點(diǎn)。將得出的土荊皮靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，得出的靶點(diǎn)為土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)

將得到的土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，將其生物物種設(shè)置為H.sapiens，根據(jù)所需要求導(dǎo)出TSV 格式上傳至Cytoscape 軟件對(duì)得出的結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析

通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)土荊皮治療淺部真菌病的有效靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析，并設(shè)置物種選項(xiàng)為H.sapiens 和P＜0.01，并 通 過(guò)Cytoscape 軟 件 構(gòu)建出成分- 通路- 靶點(diǎn)圖。

1.7 土荊皮醇提物對(duì)紅色毛癬菌的抑菌實(shí)驗(yàn)研究

1.7.1 藥物提取 先將土荊皮粉碎成粗粉，并置于無(wú)水乙醇中浸泡5 ～6h（無(wú)水乙醇：藥材為10：1），通過(guò)回流冷凝法提取1h，并用絹布過(guò)濾，得出藥液。再向藥渣中加入8 ～10 倍體積的無(wú)水乙醇，浸泡、加熱回流提取并過(guò)濾。將得到的兩次乙醇液混合，加熱過(guò)濾，并進(jìn)行減壓干燥。置于-20℃環(huán)境中冷凍至少24h，然后通過(guò)進(jìn)行真空冷凍干燥得出提取物。

1.7.2 藥敏實(shí)驗(yàn) 取PDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，高溫高壓滅菌，備用。將封存的紅色毛癬菌菌種接種于制備好的PDA 培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用棉拭子蘸取活化后的菌種溶于3mL 的生理鹽水中，用比濁儀將濃度調(diào)至0.5 麥?zhǔn)希?×106～6×106cfu/mL），再用生理鹽水稀釋至1×103～6×103cfu/mL，備用。取SDA 培養(yǎng)基和氯霉素溶于蒸餾水中，滅菌后制含藥培養(yǎng)基備用。將1g土荊皮醇提物用1mL 無(wú)水乙醇和9mL 生理鹽水進(jìn)行溶解，取2mL 藥液用二倍稀釋法分別稀釋為50 mg/mL至0.097 mg/mL 共10 個(gè)濃度。分別加入12 孔板中，隨后各孔均加入100μL 濃度為1×103～6×103cfu/mL的菌液。陽(yáng)性對(duì)照組加菌液不加藥液，空白對(duì)照組不加菌液和藥液，最后在各孔加入1mL 的SDA 培養(yǎng)基。于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7d，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組生長(zhǎng)出菌絲時(shí)，肉眼觀察加藥組沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 土荊皮的有效成分及靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出OB 值≥30%、DL值≥0.18 的有效成分共8 種，由于土荊皮丙酸無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，最終符合要求的成分為7 種，見(jiàn)表1。采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)以上7 種有效成分的藥物靶點(diǎn)，對(duì)其整理后去重得出土荊皮的109 個(gè)靶點(diǎn)，上傳至Cytoscape 軟件構(gòu)建出成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 土荊皮的有效成分

2.2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點(diǎn)獲取和PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得淺部真菌病的靶點(diǎn)421 個(gè)，將土荊皮和疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理得出治療的有效靶點(diǎn)共17 個(gè)。將土荊皮治療淺部真菌病的17 個(gè)靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，得出的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含17 個(gè)節(jié)點(diǎn)、39 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.59。導(dǎo)入Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖2。圖中可見(jiàn)IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 土荊皮治療淺部真菌病的靶點(diǎn)PPI 分析

2.3 GO 分析和KEGG 分析

將土荊皮治療淺部真菌病的17 個(gè)治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析。GO分析的結(jié)果顯示，治療靶點(diǎn)主要與缺氧反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-6 產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等相關(guān)。KEGG 通路分析得出的通路為癌癥的途徑、CLRs 信號(hào)通路、恰加斯病、Th17細(xì)胞分化。將相關(guān)的藥物成分和靶點(diǎn)上傳至Cytoscape中進(jìn)行可視化分析，得出成分—靶點(diǎn)—通路圖，見(jiàn)圖3。

圖3 土荊皮治療淺部真菌病的“成分—靶點(diǎn)—通路”圖

2.4 土荊皮醇提物對(duì)紅色毛癬菌的抑菌實(shí)驗(yàn)研究

在12 孔板的1 ～10 號(hào)孔中分別加入10 個(gè)濃度的土荊皮醇提物，并設(shè)置空白對(duì)照組（-）和陽(yáng)性對(duì)照組（+）。將12 孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)觀察至第7d 后，結(jié)果顯示土荊皮醇提物對(duì)紅色毛癬菌有明顯抑制作用，最小抑菌濃度（MIC）為1.562 mg/mL，見(jiàn)表2、圖4。

表2 土荊皮醇提物對(duì)紅色毛癬菌的抑菌作用

圖4 土荊皮醇提物對(duì)紅色毛癬菌抑制作用的鏡下觀察

3 討論

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出土荊皮的主要成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。樺木酸作為一種三萜類化合物，在濃度為8 ～128μg/mL 的范圍內(nèi)可達(dá)到殺滅真菌的效果。樺木酸的哌嗪基衍生物表現(xiàn)出與特比萘芬相似的抗真菌譜，并且是抗皮膚真菌最有效的衍生物[7]。有研究發(fā)現(xiàn)β- 谷甾醇是一種具有廣泛抗真菌活性的植物代謝產(chǎn)物，可通過(guò)結(jié)合Osh4蛋白達(dá)到抗真菌的效果[8]。國(guó)外研究表明芒柄花黃素對(duì)白色念珠菌、新生隱球菌、熱帶念珠菌等真菌都表現(xiàn)出良好的抗真菌活性，MIC 值為25 μg/mL[9]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，IL2、HSP90AA1、NOS2 等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明，由皮膚癬菌、足馬杜拉分枝菌等真菌感染引起的淺部真菌病患者的血清中，細(xì)胞因子IL-2、IL-4 的表達(dá)水平明顯提升。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，由須癬毛癬菌建立的動(dòng)物淺部真菌感染模型中，血清中IL-2、IL-6 的水平明顯升高[10]。HSP90 類蛋白在病原菌的生長(zhǎng)、毒力以及藥物耐藥性等方面具有多重調(diào)控作用，靶向HSP90 在抗真菌治療中有著巨大的潛力，研發(fā)選擇性作用于真菌HSP90 的治療藥物具有廣闊的前景[11]。田珂[12]通過(guò)臨床觀察得出，紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者外周血血清中NO 及NOS 的表達(dá)下降，這可能是導(dǎo)致感染易反復(fù)的原因之一。GO 分析顯示土荊皮主要通過(guò)缺氧反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-6 產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)等途徑對(duì)淺部真菌病產(chǎn)生作用。KEGG 分析得出土荊皮治療淺部真菌病的通路主要為癌癥的途徑、CLRs 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化等。目前有研究發(fā)現(xiàn)癌癥與真菌感染有著密切的聯(lián)系，白色念珠菌引起的感染能夠通過(guò)產(chǎn)生致癌副產(chǎn)物、引發(fā)炎癥、誘導(dǎo)Th17 反應(yīng)等促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[13]；而且，癌癥病人的免疫力低下，更易出現(xiàn)淺部真菌感染。CLRs 信號(hào)通路與淺部真菌病聯(lián)系密切，在真菌感染期間，CLRs 和Toll 樣受體(TLR)可通過(guò)識(shí)別各種真菌表面成分在宿主防御真菌病原體中發(fā)揮重要作用[14]。Th17 途徑的一些關(guān)鍵要素可被皮膚癬菌激活，如Th17 途徑的刺激可以通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞中一些CLRs 受體和炎癥小體的激活而發(fā)生，進(jìn)而參與皮膚癬菌免疫反應(yīng)[15]。另有臨床研究表明，真菌感染患者會(huì)出現(xiàn)Th17、Th17/Treg 水平的明顯降低，Th17/Treg 免疫失衡是真菌入侵機(jī)體的重要途徑[16]。紅色毛癬菌是誘發(fā)淺部真菌病的主要病原體之一，本次體外抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示土荊皮的醇提物對(duì)紅色毛癬菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度為1.562 mg/mL。有研究指出，土荊皮醇提物可通過(guò)抑制菌絲及孢子生長(zhǎng)或破壞菌絲形態(tài)來(lái)抑制紅色毛癬菌的活性。近年來(lái)，中藥抗真菌作用是臨床研究的熱點(diǎn)。高璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)，知母水提物對(duì)紅色毛癬菌有著明顯的抑制效果。劉登宇等[18]發(fā)現(xiàn)，白鮮堿對(duì)紅色毛癬菌的抑菌機(jī)制可能與抑制細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、降低耐藥性等途徑有關(guān)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)土荊皮治療淺部真菌病的主要起效成分為樺木酸、β- 谷甾醇、芒柄花黃素等。此藥通過(guò)作用于IL2、HSP90AA1、NOS2等靶點(diǎn)以及對(duì)CLRs 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化等通路的調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮對(duì)淺部真菌病的治療作用。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明土荊皮對(duì)紅色毛癬菌有著明顯的抑制作用，其機(jī)制與抑制菌絲及孢子生長(zhǎng)相關(guān)。本研究為治療淺部真菌病提供了新的思路和方向，同時(shí)也為土荊皮的開(kāi)發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。