鈦表面摻鈷-鈣磷涂層成血管作用的體外研究

瞿曉非，戚孟春，馮麗芳

華北理工大學口腔醫(yī)學院，河北唐山（063210）

種植體在植入頜骨后，其與骨組織的結合不僅取決于成骨能力，還與其周圍組織的成血管功能和血液供應有關［1］。優(yōu)良的種植材料應同時具有誘導血管和新骨形成的功能，才會形成更好的骨結合（osseointegration），臨床成功率也會更高［2］。鈷（cobalt，Co）具有成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，常被用于骨修復材料［2］；并且Co 能夠促進血管生成基因的表達和管狀結構生成［3］，加速血管形成［4］。鈣磷（Ca/P）涂層中的Ca 和P，作為成熟動物骨骼內(nèi)的主要無機成分［5］，在促成骨方面發(fā)揮巨大作用［6］，但其成血管能力有限，因此有學者主張將其與其他元素復合來改變涂層材料的理化性能及生物特性［7］。本實驗旨在研究Co 和Ca/P 復合涂層是否具有更好的促進血管生成作用，為新型鈦種植體涂層制備提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料與器材

10 mm×10 mm×1 mm 純鈦鈦片（杭州融天航瑞文科技有限公司，中國）；乙酸鈷（西隴化工，中國）；醋酸鈣（河南華瑞生物科技公司，中國）；β-甘油磷酸鈉（都萊試劑，中國）；人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）（豐暉生物，中國）；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（ACTT 公司，美國）；胎牛血清（FBS）（BI，以色列）；青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco，美國）；Matrigel 基質膠（BD，美國）；微弧氧化電源（SOYI-7003，安徽粵輝智能裝備有限公司，中國）；定時電動雙葉攪拌器（JJ-1，江蘇科技大儀器科技有限公司，中國）；倒置相差熒光顯微鏡（1-70-S8F2，Olympus，日本）；掃描電鏡（GEMINI450，Zeiss，德國）；能譜分析儀（JSM-F100，日本電子，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦片處理 將10 mm×10 mm×1 mm 的正方形鈦片依次用500#、800#、1 000#、1 500#碳化硅砂紙依次拋光，然后依次在乙醇、去離子水中超聲清洗15 min，室溫干燥。

1.2.2 實驗分組根據(jù)微弧氧化電解液加入元素成分不同，制備的涂層分為摻鈷組（Co 組）、摻鈷-鈣磷組（Co-Ca/P 組）和純鈦片對照組（Ti 組）。

1.2.3 涂層制備 采用微弧氧化法制備涂層。以預處理的鈦片為陽極，陰極選用不銹鋼塊，兩極間距10 cm，兩極完全浸沒于電解液中；電動攪拌棒置于兩極之間，以25 r/min 速度攪拌，使電解質溶液得以分布均勻。涂層制備采用交流電模式：正向電壓500 V，反向電壓150 V，正向電流3 A，反向電流1.5 A，正占空比為80%，反占空比50%，處理時間為10 min。Co-Ca/P 涂層所用電解液含乙酸鈷、醋酸鈣和β-甘油磷酸鈉，按鈷：（鈷＋鈣）=1∶5的比例配制電解液，取β-甘油磷酸鈉8.64 g，醋酸鈣39.54 g，乙酸鈷8.85 g 溶于500 mL 去離子水中；Co涂層電解液的制備為取乙酸鈷8.85 g溶于500 mL去離子水中。涂層制備后，試件置于去離子水中超聲震蕩處理5 min，常溫干燥。

1.2.4 涂層理化性質檢測 應用場發(fā)射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察各組試件表面微觀形貌；應用能譜分析儀（energy dispersive spectrometer，EDS）對鈦試件表面元素進行分析，每組選擇3 個試件測量。

1.2.5 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。ECM 培養(yǎng)基成分為DMEM（930 μL/mL）+FBS（50 μL/mL）+內(nèi)皮細胞生長因子（10 μL/mL）+青霉素/鏈霉素（10 μL/mL）。每2 d 換1 次培養(yǎng)基，待細胞融合達80%左右時，用胰蛋白酶消化傳代；選用第3 代細胞進行試驗。

1.2.6 浸提液制備 3 只離心管分別注入3 mL ECM 培養(yǎng)液，分別放入已制備好的Co、Co-Ca/P、Ti組試件，每組5 個大小為10 mm × 10 mm × 1 mm。浸泡3 d，制備相應的標準浸提液，用于體外血管生成實驗。

1.2.7 體外微血管形成實驗 將-20 ℃保存的基質膠在4 ℃冰箱里溶解過夜，在96 孔板內(nèi)每孔加50 μL 基質膠，于37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min 至膠凝結。取第3 代生長良好的HUVECs 用浸提液制備成細胞懸液，按6 × 105個/mL 均勻接種于基質膠上，每孔加入0.5 mL 細胞懸液，每組設置3 個孔。培養(yǎng)4、8 h 后倒置相差顯微鏡下觀察微血管形成情況，每孔隨機選取6 個視野進行拍照，照片使用Image J（v1.8.0.172）圖像處理軟件進行分析，比較3 組微血管環(huán)數(shù)（血管管壁圍繞形成圓環(huán)的個數(shù)）和節(jié)點數(shù)（2 個或2 個以上血管管壁交叉形成的交點個數(shù)）差異。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。定量資料使用均數(shù)±標準差表示，對3 組微血管環(huán)及節(jié)點數(shù)進行單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 涂層大體觀察

Co 組顯示為深灰色涂層，Co-Ca/P 組顯示為淡粉色涂層，Ti 組則顯示出純鈦片的原本金屬色澤（圖1）。

Figure 1 Obervation of coatings on titanium surfaces in three groups圖1 三組鈦表面涂層大體觀察

2.2 試件微觀形貌觀察

經(jīng)微弧氧化處理的Co 組、Co-Ca/P 組涂層表面除孔隙外，出現(xiàn)了許多不規(guī)則晶體沉積，晶體直徑大多＜2 μm；晶體沉積間有少量微孔，數(shù)目較少且分散，考慮是微弧氧化處理時晶體沉積覆蓋所致。與Co 組比較，Co-Ca/P 組沉積的晶體較多且分布均勻；而未經(jīng)微弧氧化的Ti 組則只觀察到打磨留下的劃痕，未見到微孔及晶體沉積（圖2）。

Figure 2 Micromorphology of coatings on titanium surfaces under scanning electron microscope observation圖2 掃描電鏡下觀察鈦表面涂層表面微觀形態(tài)

2.3 涂層元素能譜分析

EDS 分析結果顯示（圖3，表1），Co 組元素檢測顯示只有Co、Ti 和O 元素，說明Co 被摻入到涂層表面；Co-Ca/P 組除了Co、Ti、O，還有Ca、P 等元素，說明Co 和Ca、P 元素一起被摻入到涂層中。Ti 組顯示只有Ti 和O 元素，說明無三種元素摻入。

Figure 3 Element analysis of three groups coatings on titanium surfaces by energy dispersive spectrometer圖3 三組鈦表面涂層元素能譜分析圖

表1 鈦表面涂層表面化學元素成分及含量的能譜分析（n=3）Table 1 Element composition and content of coatings on titanium surfaces analysized by energy dispersive spectrometer(n=3)mass%,±s

表1 鈦表面涂層表面化學元素成分及含量的能譜分析（n=3）Table 1 Element composition and content of coatings on titanium surfaces analysized by energy dispersive spectrometer(n=3)mass%,±s

Co group:cobalt-loaded group;Co-Ca/P group:cobalt and calcium-phosphorus group;Ti group:untreated pure titanium group

Ca Element O Ti Co P-0.73±0.11-Co group Co-Ca/P group Ti group 33.92±4.26 38.36±3.72 18.75±0.72 44.08±19.12 22.82±16.47 81.25±3.68 22.00±12.15 36.85±5.23--1.24±0.18-

2.4 體外微血管生成

利用體外微血管生成實驗來檢驗Co-Ca/P 涂層的促血管生成能力。結果顯示，細胞培養(yǎng)4 h 后，三組涂層表面均出現(xiàn)了管腔樣結構，其中Co-Ca/P 組微血管環(huán)數(shù)和節(jié)點數(shù)最高，其次為Co 組，而Ti 組最低（P＜0.05），說明Co 具有促進微血管生成的能力，而Ca、P 元素的加入會進一步增強Co 的促血管生成作用。

細胞培養(yǎng)8 h 后，三組涂層表面生成的微血管較4 h 時更多更粗，且有更多血管環(huán)和節(jié)點。三組比較，Co-Ca/P 組血管環(huán)數(shù)及節(jié)點數(shù)仍然最高，其次為Co 組，而Ti 組最少（P＜0.05）；進一步證明了Co的促微血管生成作用及Co、Ca、P 三種元素聯(lián)合應用進一步促進微血管生成的效果（圖4）。

Figure 4 Microangiogenesis of different coatings on titanium surfacesin vitro圖4 鈦表面不同涂層的體外微血管生成情況

3 討 論

鈦種植體植入體內(nèi)后，其周圍頜骨組織良好的成骨能力是種植體骨結合成功的關鍵；然而，這些過程離不開局部骨組織良好的血液供應；因而，種植體植入后局部骨組織的重新血管化或新血管再生成為種植體骨結合的必備前提，對提高種植體成功率具有重要意義。

種植體植入后，骨組織局部微環(huán)境中血管內(nèi)皮細胞可以在各種信號刺激下，發(fā)生增殖、遷移、微血管重構和形成［8］，從而為新生骨組織提供血液和養(yǎng)分；同時，骨微環(huán)境中基質細胞、成骨細胞及血管內(nèi)皮細胞自身還可分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和各種細胞因子，作為信號蛋白調(diào)控微血管生成［9］，加快新骨形成，促進種植體骨結合［10］。除上述促血管生長因子及細胞因子外，一些金屬元素也被證實具有促微血管生成的作用，如鎂、銅、鈷、鋅等［8,11-14］；因而在種植體表面涂層中引入適合的金屬元素，達成促進種植體周圍微血管生成，加速新骨形成，促進種植體骨結合的目的；該策略已成為研發(fā)新型高生物活性涂層種植體的新思路。本研究正是基于該思路，首次通過微弧氧化方法將具有成血管能力的Co 與Ca、P 元素結合，制備摻Co-Ca/P 復合涂層，以證實該復合涂層促進HUVECs 體外微血管生成的能力。掃描電鏡及能譜分析，均證實三種元素被成功摻入Co-Ca/P 復合涂層，涂層表面具有含三種元素的晶體。

Co 良好的促進微血管生成能力已被許多既往研究證實［2-3,15］。Zhao 等［2］利用Co 支架體外誘導血管形成，證明摻Co 浸提液可以促進HUVECs 增殖，并形成血管樣結構。Co 還可通過模擬缺氧條件來促進血管生成［16］。Co2+作為脯氨酰羥基化抑制劑，可抑制低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解并使其穩(wěn)定；HIF-1α 可上調(diào)血管生成基因VEGF 的表達［17］，從而有利于血管的生成。在血管生成信號的刺激下，HUVECs 增殖、遷移、分化，多個信號通路調(diào)節(jié)這一過程，進而加速血管生成［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，摻Co 涂層較純Ti 試件組具有更好的微血管生成能力，進一步證實了Co的促血管生成作用。既往研究只單獨驗證了Co 對成血管的作用；本研究在證實Co 促微血管形成能力的同時，在摻Co 涂層中進一步引入了Ca、P 元素，以期進一步增強涂層的生物學效應。

既往研究發(fā)現(xiàn)，Ca/P 涂層釋放的Ca 和P 離子同樣具有促進血管再生的作用［18］。Ca、P 元素是生物體硬組織中無機成分的重要組成部分，其生物活性與骨誘導性優(yōu)異，多用于骨組織修復的表面涂層中。但該涂層韌性低、脆性大，限制了其臨床應用［19］。戴文捷［20］通過溶膠-凝膠法和仿生礦化法在鈦合金基體表面制備鍶鎂離子摻雜鈣磷涂層，發(fā)現(xiàn)同時增強了成骨和成血管生物活性，為種植體改性和骨整合改善提供了參考。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人體骨骼內(nèi)最常見的鈣磷化合物，是一種能促進體內(nèi)成骨、提高組織相容性的良好涂層［21］。作為骨無機質的成分之一，HA 能誘導骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨細胞分化，極大地促進種植體骨結合［22］。骨折的修復是一個再生過程，骨生長支架在血管再生和成骨中發(fā)揮巨大作用，它可以通過拓撲結構和微觀尺度差來實現(xiàn)細胞黏附及血管再生，從而實現(xiàn)骨生成［23］。血管再生促進骨生成，反之良好的骨再生促進骨內(nèi)血管新生，如此循環(huán)往復，更好達到成骨的作用［24-26］。尹先珍［25］通過層層自組裝法在攜載抑炎因子白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）的二氧化鈦納米管表面制備海藻酸鈉/殼聚糖自組裝膜,顯著促進了內(nèi)皮細胞的黏附與生長，可誘導生成較多血管，IL-4 控釋體系具有良好骨免疫調(diào)節(jié)性能，通過其表面特性與巨噬細胞共同作用，顯示出優(yōu)異的促進體內(nèi)外血管生成和修復骨組織缺損的作用［27-29］。王青等［24］發(fā)現(xiàn)利用化學沉積法制備的含有Ca/P 涂層的鋁合金支架能夠在體內(nèi)外促進血管新生和修復骨缺損。龍智生等［28］發(fā)現(xiàn)HA/CS（chitosan）微管結構在成血管與成骨方面具有顯著的優(yōu)良效果。Suo 等［30］利用電泳沉積法制備HA/CS/GO（graphene oxide）復合涂層，證明該涂層可以促進BMSCs 的生長與分化，并且促進了體內(nèi)種植體骨結合的能力。近年來國內(nèi)外有關鈦種植體Ca/P 涂層促微血管生成的研究較少，它們與Co 元素的聯(lián)合應用更未見報道。

根據(jù)本研究得出的結論：Ca/P 與Co 聯(lián)合制備的微弧氧化涂層，微血管環(huán)及血管節(jié)點數(shù)均顯著高于單獨摻Co 涂層組，證實體外三種元素聯(lián)合應用在涂層中可進一步增強微血管生成能力，從而進一步提高鈦金屬涂層的生物活性。

綜上所述，本研究通過微弧氧化法在鈦金屬表面成功制備了摻Co-Ca/P 復合涂層；該涂層具有獨特的微觀形貌和沉積的晶體，在體外比純鈦試件及單獨摻Co 涂層具有更好的成血管能力，為新型高生物活性鈦種植體涂層的研發(fā)提供了新思路。

【Author contributions】Qu XF designed the study, collected and processed the data, wrote the article.Qi MC revised the article and designed the study.Feng LF revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.