動物科學(xué)專業(yè)《細(xì)胞分子生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革實(shí)踐
——以綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)為例

段志強(qiáng)，趙佳福，張依裕，李 輝，陳 祥

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

細(xì)胞分子生物學(xué)是細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)相互滲透與交融的一門學(xué)科，主要通過研究細(xì)胞內(nèi)生物大分子（如核酸和蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)，現(xiàn)已成為生物醫(yī)藥、生物遺傳與進(jìn)化、農(nóng)林牧漁等生命科學(xué)領(lǐng)域非常重要的基礎(chǔ)學(xué)科。由于細(xì)胞分子生物學(xué)具有很強(qiáng)的應(yīng)用性和實(shí)踐性，因此開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)對學(xué)生理解和鞏固基礎(chǔ)理論知識、掌握試驗(yàn)研究方法和操作技術(shù)、提高實(shí)踐動手能力和創(chuàng)新能力具有重要的作用。動物科學(xué)專業(yè)作為是生命科學(xué)專業(yè)的一個分支，其培養(yǎng)目標(biāo)是讓學(xué)生認(rèn)識和掌握動物遺傳變異、生長發(fā)育、消化代謝等生命規(guī)律，為人們提供質(zhì)優(yōu)量多的動物產(chǎn)品。同時，隨著科技的不斷發(fā)展，各種細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)層出不窮，動物科學(xué)研究領(lǐng)域已深入到動物細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平和分子水平，這對細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)提出了更高的要求。

貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院為動物科學(xué)專業(yè)本科生在二年級上學(xué)期開設(shè)細(xì)胞分子生物學(xué)課程，但是在動物科學(xué)專業(yè)培養(yǎng)方案中，相關(guān)的課程如生物化學(xué)、生物技術(shù)概論、動物分子遺傳學(xué)等與本課程同時或之后開設(shè)，因?yàn)閷W(xué)生沒有前期知識積累，在基礎(chǔ)理論學(xué)習(xí)和實(shí)踐操作方面會大打折扣，這直接影響了學(xué)生學(xué)習(xí)本課程的興趣以及創(chuàng)新思維的培養(yǎng)。因此，為提高實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)效果，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新意識，經(jīng)過不斷的實(shí)踐和探索，我們以綠色熒光蛋白基因表達(dá)綜合實(shí)驗(yàn)為例，在創(chuàng)新型設(shè)計(jì)性實(shí)踐教學(xué)上取得了良好的教學(xué)效果。

1 綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 文獻(xiàn)檢索分析 綠色熒光蛋白作為一種獨(dú)特的報告蛋白和標(biāo)記蛋白，已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)定位與相互作用、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖分化等研究領(lǐng)域。在學(xué)生學(xué)習(xí)和了解綠色熒光蛋白功能的基礎(chǔ)上開展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要包括基因的PCR 擴(kuò)增、載體的酶切和連接、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取與鑒定、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、蛋白熒光觀察等步驟。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)安排，學(xué)生以“綠色熒光蛋白”和“基因表達(dá)”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、NCBI PubMed、Web of Science 等中英文數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，從多方面了解和熟悉綠色熒光蛋白與基因表達(dá)的技術(shù)方法。因此，學(xué)生通過對大量相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，體會到新技術(shù)對科學(xué)發(fā)展的推動作用，不僅拓寬了視野、開闊了思維，而且對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作也產(chǎn)生了濃厚的興趣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)與實(shí)施 學(xué)生通過對綠色熒光蛋白基因表達(dá)相關(guān)文獻(xiàn)的檢索分析，開展實(shí)驗(yàn)整體方案的設(shè)計(jì)（圖1）。在此基礎(chǔ)上，教師對學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行了修改和補(bǔ)充，把基因擴(kuò)增與回收、載體構(gòu)建與鑒定、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、蛋白熒光觀察等基本操作過程細(xì)化，形成了一個完整連續(xù)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（圖1）。通過組織學(xué)生開展實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，不僅加深了學(xué)術(shù)對細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)知識體系的認(rèn)識，明白了實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程涉及多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用并需要團(tuán)隊(duì)協(xié)作完成，而且培養(yǎng)了學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力以及團(tuán)隊(duì)合作意識。

圖1 綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

為了讓學(xué)生更好的熟悉實(shí)驗(yàn)具體操作，在教師的指導(dǎo)和啟發(fā)下，學(xué)生對實(shí)驗(yàn)計(jì)劃的細(xì)節(jié)進(jìn)行完善和補(bǔ)充。如圖2 所示，在實(shí)驗(yàn)計(jì)劃方案的第⑤階段，即菌液PCR 的鑒定和重組質(zhì)粒的提取純化操作流程進(jìn)行了補(bǔ)充，使得這個實(shí)驗(yàn)過程簡單易懂，具有較強(qiáng)的可操作性。

圖2 菌液PCR 的鑒定和重組質(zhì)粒的提取純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

1.3 啟發(fā)式和討論式教學(xué)方法的聯(lián)合運(yùn)用 啟發(fā)式教學(xué)是教師在教學(xué)工作中根據(jù)教學(xué)任務(wù)和學(xué)習(xí)過程的客觀規(guī)律，采用多種方式，引導(dǎo)學(xué)生積極、主動、自覺的學(xué)習(xí)知識的一種教學(xué)方法。它的實(shí)質(zhì)在于正確處理了教與學(xué)的相互關(guān)系，使學(xué)生由消極被動的被灌輸知識到主動獲取知識的轉(zhuǎn)變，反映出了教學(xué)的客觀規(guī)律，在許多國家的教學(xué)改革中均有應(yīng)用。討論式教學(xué)是與講授式教學(xué)相對應(yīng)的概念，它摒棄了傳統(tǒng)的灌輸式和填鴨式的教學(xué)方法，通過教師對學(xué)生的思維加以引導(dǎo)和啟發(fā)，使全體學(xué)生積極參與課堂討論，從而實(shí)現(xiàn)教與學(xué)的互動。這種教學(xué)方法在教學(xué)法體系中占有非常重要的地位，不僅使學(xué)生處于積極探索和思考問題的良好狀態(tài)，而且能培養(yǎng)和提高學(xué)生獨(dú)立分析問題和解決問題的能力。因此，在教學(xué)實(shí)踐過程中，聯(lián)合采用啟發(fā)式教學(xué)和討論式教學(xué)的方法往往會獲得更好的教學(xué)效果。

在綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)開始以前，教師首先針對每一階段的實(shí)驗(yàn)過程提出一些問題，如為什么在管中混合加入DNA 聚合酶、引物和模板等就能在PCR 儀中進(jìn)行基因的擴(kuò)增？為什么可以用菌液進(jìn)行目的基因的PCR 擴(kuò)增和鑒定？細(xì)胞為什么經(jīng)過固定和破膜以后才能進(jìn)行細(xì)胞核的染色？通過這種方式引導(dǎo)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作之前結(jié)合課堂講授的知識來思考問題，加深對所學(xué)知識的理解和記憶。在獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果以后，采用分組討論的方式對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和總結(jié)。對效果較好的一個教學(xué)討論進(jìn)行展示（圖3）：學(xué)生在平行操作的10 組實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有明顯的差異，7 組和8 組的電泳條帶較淡，而9組和10 組沒有檢測到條帶。同學(xué)們仔細(xì)回顧和分析了實(shí)驗(yàn)操作中的步驟，從PCR 加樣、混勻、配膠、電泳等過程中可能出現(xiàn)的原因進(jìn)行了熱烈的討論，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 組和8 組的同學(xué)在電泳加樣過程中出現(xiàn)了樣品外溢，而9 組和10 組的同學(xué)在PCR 反應(yīng)中沒有加入引物。

圖3 菌液PCR 電泳檢測結(jié)果圖

再如圖4 所示，在綠色熒光蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位觀察結(jié)果中，綠色熒光蛋白呈現(xiàn)綠色，而細(xì)胞核熒光呈現(xiàn)藍(lán)色，兩種熒光重合以后則呈現(xiàn)青色。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，單純的綠色熒光蛋白熒光與細(xì)胞核熒光沒有完全重合，而融合表達(dá)了SV40 大T 抗原核定位信號（SV40/NLS）的綠色熒光蛋白與細(xì)胞核熒光完全重合（圖4），提示綠色熒光蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有定位，而NLS 的存在則能使綠色熒光蛋白完全進(jìn)入細(xì)胞核。同學(xué)們對上述綠色熒光蛋白的定位和顏色變化很感興趣，結(jié)合課堂所學(xué)知識，經(jīng)過討論還得出了其它熒光之間的重合可能還會出現(xiàn)黃色、橙色和紫色。另外，同學(xué)們將細(xì)胞膜通透性知識應(yīng)用到本實(shí)驗(yàn)中，得出細(xì)胞膜對物質(zhì)的運(yùn)輸具有選擇性，正常情況下細(xì)胞核染料DAPI 不能進(jìn)入細(xì)胞核，而Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔使得DAPI 進(jìn)入細(xì)胞核染色。同時，針對融合表達(dá)了SV40/NLS 的綠色熒光蛋白完全定位細(xì)胞核，討論得出蛋白質(zhì)的靶向運(yùn)輸需要信號肽的參與，NLS 的存在可以使蛋白質(zhì)完全進(jìn)入到細(xì)胞核中。因此，在每一階段開展的實(shí)驗(yàn)中，綜合運(yùn)用啟發(fā)式和討論式教學(xué)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的探討分析并寫進(jìn)實(shí)驗(yàn)報告，使學(xué)生對實(shí)驗(yàn)課程的興趣和理論知識的理解得到進(jìn)一步加深。

圖4 綠色熒光蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位結(jié)果和觀察分析

2 實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革效果分析

通過動物科學(xué)專業(yè)綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的開展，培養(yǎng)了學(xué)生的科研思維，加強(qiáng)了學(xué)生實(shí)踐操作和動手能力，基本達(dá)到了課程既定的目標(biāo)。通過實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)改革，我們對實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中和課程結(jié)束后的教學(xué)反思與問題反饋也進(jìn)行了改進(jìn)和提升，取得了良好的教學(xué)效果。

2.1 實(shí)驗(yàn)課程具有連續(xù)性和可行性 目前，貴州大學(xué)動物科學(xué)專業(yè)細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課課時僅有9學(xué)時，在短時間內(nèi)完成9 次實(shí)驗(yàn)課程顯得時間不足。因此，在正常的教學(xué)時間外，征求同學(xué)們的意見在周末時間也開展部分實(shí)驗(yàn)，保證了實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性。另外，實(shí)驗(yàn)課程報告要求學(xué)生按照論文的格式寫成一篇課程論文，包含中英文摘要，材料與方法、結(jié)果、討論，以及對實(shí)驗(yàn)課程的意見和建議等部分。因此，通過對實(shí)驗(yàn)操作過程、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察分析和課程論文的寫作，不僅加強(qiáng)了學(xué)生實(shí)踐動手能力，還培養(yǎng)了學(xué)生的科研素養(yǎng)和研究論文的寫作能力，具有較好的可行性。

2.2 實(shí)驗(yàn)課程達(dá)到了教學(xué)相長的效果 教學(xué)相長的目的是通過教與學(xué)的交往互動，使教學(xué)兩方面互相影響和促進(jìn)，從而提高教學(xué)水平。實(shí)驗(yàn)課程的實(shí)施為師生再一次提供了相互溝通的平臺，激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)的熱情和積極主動性。例如，實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒的提取使用的是質(zhì)粒提取試劑盒，其中包含了Solution I、Solution II、Solution III 等試劑，但是學(xué)生對它們的成份和具體作用并不清楚。有些同學(xué)查閱文獻(xiàn)得知通過堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)過老師的引導(dǎo)以及同學(xué)的分析討論，得出Solution I 對應(yīng)于堿裂解法中的溶液I，主要由葡萄糖、EDTA 和Tris-HCl 組成，作用是減少質(zhì)粒抽提過程中對質(zhì)粒的機(jī)械剪切和DNA 酶對質(zhì)粒的降解。學(xué)生把上述分析討論寫進(jìn)課程論文，加深了對實(shí)驗(yàn)課程的深入理解，培養(yǎng)了分析問題和解決問題的能力，同時也進(jìn)一步提升了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和科研熱情。以2021 年為例，動物科學(xué)專業(yè)本科生對本實(shí)驗(yàn)課程滿意或基本滿意的達(dá)到了95.71%；申請獲得與細(xì)胞分子生物學(xué)相關(guān)的國家級、省級和校級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目以及校級SRT 項(xiàng)目的數(shù)量達(dá)到了12 項(xiàng)；考研率從2011 年的14.29%提高到58.93%。

2.3 實(shí)驗(yàn)課程促進(jìn)和提升了其它課程教學(xué)效果 實(shí)驗(yàn)室是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐動手能力的主要場所，同時也是開展創(chuàng)新實(shí)踐的重要實(shí)驗(yàn)平臺。貴州大學(xué)重視實(shí)驗(yàn)室安全教育，為本科生開設(shè)了實(shí)驗(yàn)安全課程，在利用課程宣講實(shí)驗(yàn)安全知識、培訓(xùn)安全操作和安全防護(hù)技能的基礎(chǔ)上，更多的需要讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作過程中了解安全知識和注意個人防護(hù)。動物科學(xué)專業(yè)本科生在學(xué)習(xí)期間多數(shù)人會進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室開展科研，本課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開展讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中了解化學(xué)試劑的危害以及操作儀器可能會發(fā)生的潛在危險，為實(shí)驗(yàn)安全課程的教學(xué)提供了豐富的素材。另外，生物化學(xué)、動物分子遺傳學(xué)、生物技術(shù)概論等相關(guān)的課程開設(shè)在本課程之后，并且存在實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時少或未開設(shè)實(shí)驗(yàn)的情況。因此，細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程是對上述其它課程教學(xué)的補(bǔ)充，提升了以上課程的教學(xué)效果。

3 結(jié)語

通過對動物科學(xué)專業(yè)細(xì)胞分子生物學(xué)以綠色熒光蛋白基因表達(dá)為主題實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改革探索，在提升學(xué)生實(shí)踐動手能力和創(chuàng)新能力的同時，教師的教學(xué)水平也得到了進(jìn)一步提高，同時對學(xué)院的其它實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)和改革也起到了一定的推動與促進(jìn)作用。由于綠色熒光蛋白基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)周期相對較長，不同實(shí)驗(yàn)階段可能出現(xiàn)的問題較多，更加說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)細(xì)致操作的重要性，以及實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報告的必要性。另外，在教學(xué)反思與問題反饋過程中也發(fā)現(xiàn)了一些新的問題，比如如何讓連續(xù)的實(shí)驗(yàn)時間安排更加合理，讓每個學(xué)生都有更多的實(shí)驗(yàn)操作動手機(jī)會，以及編寫適合動物科學(xué)專業(yè)的細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)指導(dǎo)書等等。我們將繼續(xù)在實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革實(shí)踐中不斷完善，使實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)效果得到充分的體現(xiàn)，不斷推進(jìn)“理論-實(shí)踐-創(chuàng)新設(shè)計(jì)”的學(xué)習(xí)模式，培養(yǎng)具有創(chuàng)新能力的應(yīng)用型復(fù)合型人才。