高效液相色譜法測定番茄醬中蘇丹紅I 的方法

◎梁 磊，陳春輝

（甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗檢測研究院，甘肅 張掖 734000）

蘇丹紅為親脂性偶氮化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四種，主要用于工業(yè)染色，因為我國食品藥品監(jiān)督管理局禁止將蘇丹紅作為食品添加劑用于改變食品的外觀和色澤。在番茄制品中，番茄紅素[1]的含量是評判番茄制品等級的重要依據(jù)。但是，由于番茄紅素穩(wěn)定性較差，不利于長期保存，考慮到其吸收波長與蘇丹紅較為接近，且番茄制品中番茄紅素含量的國家標準[2]以蘇丹紅[3]作為參考標準物質(zhì)，所以，部分不法商戶為了牟取利益，以添加蘇丹紅的方式提高番茄紅素的檢測值。

作為食品中非法添加的蘇丹紅I 色素檢測方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[4-5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）[6]和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法[7]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度高、分辨率好，但存在較強的基質(zhì)效應，對前處理要求高，檢測成本較大；雖然已有報道采用免疫法[8]、電化學分析法[9]等新手段可以減少基質(zhì)感染，獲得較為準確的結果，但因設備或相關標準的普及程度難以大規(guī)模應用。高效液相色譜法普及性好，同時在使用二極管陣列檢測器時可以通過光譜進行輔助定性，所以在蘇丹紅的檢測上得到了廣泛應用。本研究嘗試以高效液相色譜法為檢驗方法，通過優(yōu)化樣品前處理方法，以期達到對番茄醬中蘇丹紅I 的準確檢驗，為日常監(jiān)管與檢驗提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄醬樣品均購自當?shù)爻?。蘇丹紅Ⅰ標準溶液（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；中性氧化鋁（100～200 目，天津光復化學試劑公司）；實驗用水為密理博純水系統(tǒng)（美國）制得的超純水。

1.2 儀器與設備

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配SPD-M20A 型光電二極管陣列檢測器和Labsolution工作站；SB25-120 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；渦旋儀；ME204 型電子天平（梅特勒-托利多）；移液槍（賽默飛世爾）。

1.3 標準溶液的配置

蘇丹紅I 標準中間液（2.0 μg/mL）：用移液槍準確吸取500 μL 蘇丹紅I 標準溶液，以正己烷定容至25 mL。

蘇丹紅I 標準工作液的配置：分別用移液槍準確吸取蘇丹紅I 標準中間液0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 mL，將正己烷定容至1 mL，制成0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 的標準曲線工作液。

1.4 樣品的制備

精密稱取10 g 樣品，放入離心管，加入10 mL 水將其分散成糊狀，加入30 mL 正己烷：丙酮（3:1）混合溶液，渦旋5 min，4 000 r/min 離心10 min，吸出正己烷層，重復上述操作2 遍，合并3 次正己烷，加入無水硫酸鈉5 g 脫水，旋蒸至干，加5 mL 正己烷復溶，慢慢加入氧化鋁層析柱，待吸附完全后，使用正己烷10 mL 進行洗脫，棄去洗脫液，然后用5%丙酮正己烷50 mL 洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，加丙酮5 mL 復溶，過0.45 μm 濾膜后進樣。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。檢測波長分別為478 nm。流動相A 為0.1%甲酸水-乙腈（85:15），流動相B 為0.1%甲酸乙腈-丙酮（80:20），截取15 min 采集數(shù)據(jù)。采用梯度洗脫，見表1。

表1 梯度條件表

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件與檢測波長的選擇

通過比較乙腈-水、甲醇-水、水-乙腈-丙酮等體系，分離效果并未出現(xiàn)較大差別。但考慮食品樣品本身因制作工藝不同而導致的基質(zhì)影響差異，所以在流動相中加入0.1%甲酸，讓整體流動相呈現(xiàn)酸性，來保證洗脫時的保留時間穩(wěn)定性。通過光譜結果可知，蘇丹紅I 色素最大吸收波長出現(xiàn)在478 nm 處，且在該波長下被測物無干擾，故選擇該波長作為蘇丹紅I 的檢測波長。樣品檢測結果見圖1。

圖1 蘇丹紅1 樣品典型圖譜圖

2.2 樣品提取劑的確定

根據(jù)蘇丹紅I 的化學性質(zhì)，其具有較強的脂溶性，所以在提取時，直接選擇具有弱極性的正己烷作為提取劑，一方面是增加蘇丹紅I 的提取效率，另一方面也避免了引入過多極性雜質(zhì)，為后續(xù)凈化提供便利條件。

2.3 凈化方式的優(yōu)化

因蘇丹紅I 化學結構中富含共軛結構，可以被氧化鋁所吸附，且正己烷可以在洗脫油脂等干擾組分的同時，保證被吸附的蘇丹紅I 不被洗脫，所以，蘇丹紅I 提取液凈化條件的選擇在相關標準中規(guī)定為采用降活處理的中性氧化鋁作為吸附劑，經(jīng)正己烷淋洗去除油脂和其他雜質(zhì)后，以5%丙酮正己烷溶液作為洗脫液進行洗脫。該方法中因氧化鋁活性因生產(chǎn)廠家不同存在一定差異，且烘干溫度與時間都會對其活化效率產(chǎn)生影響，加水降活操作也會因為檢驗人員操作習慣不同，存在降活不均勻，降活程度差異大等問題。所以，本方法采用105 ℃干燥2 h的充分活化方法，不進行加水降活處理，盡可能保證氧化鋁活性的一致性，提高實驗穩(wěn)定性。同時在洗脫過程中，通過嘗試不同比例丙酮-正己烷溶液，最后確定為采用含有30%丙酮的正己烷溶液作為淋洗液。通過對比，干擾峰明顯減少，凈化效果良好，具體參見圖2。

圖2 未凈化（左）與經(jīng)氧化鋁凈化（右）樣品譜圖

2.4 濾膜的選擇

在相關標準中，對于濾膜只規(guī)定為采用有機濾膜，但在實驗中發(fā)現(xiàn)，采用常見尼龍（Nylon）材質(zhì)有機濾膜時，可以在過濾時看到濾膜上有明顯的紅色染料殘留，而聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）則無明顯吸附現(xiàn)象?？紤]到日常其他實驗中的通用型，最終選擇PTFE 濾膜。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程、檢出限與定量限結果

對0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 標準曲線工作液分別進樣，并進行線性擬合，得到線性方程：f（x）=38 313.3×x，擬合度R2=0.999 5，曲線現(xiàn)行良好。同時，以S/N=3 為檢出限（LOD），S/N=10 為定量限（LOQ）進行計算，得到該方法LOD 為7.4 μg/kg，LOQ為24.7 μg/kg，通過實際加標相近濃度驗證，也得到了相似結果。通過與國標進行比對，本方法測得的LOD 與LOQ 完全滿足常規(guī)檢測。

2.5.2 準確度、回收率與精密度結果

本方法進行三水平三平行加標驗證，分別稱取10 g空白基質(zhì)，加入0.1 mL，0.5 mL，1 mL 濃度為10 μg/mL的蘇丹紅I 標準溶液，制成含0.1、0.5、1.0 μg/kg 的加標樣品，依照上文方法進行提取凈化后，對方法的回收率和精密度進行評估，其中低水平為線性范圍的最低點，準確度用加標水平的回收率評價。結果如表2 所示。

表2 加標回收率表

由表2 可知，該方法在線性范圍內(nèi)，均具有較穩(wěn)定的回收率，其平均回收率為92.61%，不同濃度范圍內(nèi)RSD 在1.22%～3.41%，說明該方法的準確性良好。

取同一濃度標準品溶液（均取0.5 μg/mL），重復進樣6 次，測定其峰面積并計算RSD 值，結果小于2.0%，精密度良好。

3 結語

本試驗對番茄醬中蘇丹紅I 號檢驗方法進行了優(yōu)化，通過對提取溶劑、檢測波長的選擇、流動相的優(yōu)化，有效縮短了出峰時間，改善了峰形。同時，針對標準中中性氧化鋁柱填料活化/降活操作不穩(wěn)定的問題，通過取消降活操作，優(yōu)化淋洗液比例的方式，有效提高了凈化穩(wěn)定性和凈化效果。通過實驗表明，該方法穩(wěn)定性和準確性良好，精密度高，可以適用于番茄醬中蘇丹紅I 的日常檢測。