不同砧穗組合對獼猴桃潰瘍病的抗性差異及機制分析

賀占雪，朱太富，李 欣，蘇效蘭，劉惠民，王連春

（1.西南林業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650224；2.麗江市經(jīng)濟作物工作站，云南 麗江 674100；3.西南林業(yè)大學 林學院，云南 昆明 650224）

獼猴桃細菌性潰瘍?。↘iwifruit bacterial canker）是一種由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的細菌性病害，被稱為獼猴桃病害中的癌癥，在全國各大獼猴桃產(chǎn)區(qū)不斷蔓延，已經(jīng)成為制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸[1]。獼猴桃品種繁多，不同品種對潰瘍病的抗性存在差異。獼猴桃種植過程中嫁接是最普遍的繁殖方法，通過嫁接可保持接穗品種的優(yōu)良特性，提高抗病蟲害、耐濕抗?jié)澈涂购饶芰2]。研究發(fā)現(xiàn)，選育抗性砧木進行嫁接，可以提高嫁接苗的抗逆性[3]。王紹輝等[4]研究發(fā)現(xiàn)，以抗根結(jié)線蟲的番茄為砧木，嫁接后可以有效提高感病品種彩虹101 對根結(jié)線蟲的抗性；鮑文武[5]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃抗旱砧木對嫁接植株生長發(fā)育的影響顯著高于接穗對嫁接植株的影響；馬志堯[6]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃嫁接苗的抗逆性顯著優(yōu)于實生苗。因此，利用野生獼猴桃抗逆性高、對環(huán)境的適應能力強等特點，選育抗病砧木，然后通過嫁接等方式改變優(yōu)良栽培品種的抗逆性，篩選出優(yōu)質(zhì)資源應用于實際栽培，是防治獼猴桃潰瘍病較高效、經(jīng)濟的方法。

植物生長在復雜的自然環(huán)境中，經(jīng)常會遭遇逆境，遇到逆境時會啟動自身防衛(wèi)保護機制，首先通過調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透物質(zhì)或相關酶類來提高自身抗逆能力[7-8]。因此，生化指標的變化在一定程度上可以反映植物的抗逆性。大量的研究結(jié)果表明，病原物侵染植物時會誘發(fā)一系列的防衛(wèi)反應，植物體內(nèi)過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性以及可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量會發(fā)生變化[9-12]。石志軍等[13]和高小寧等[14]的研究結(jié)果表明，獼猴桃體內(nèi)防御酶活性以及可溶性糖、脯氨酸含量與獼猴桃抗?jié)儾〈嬖诓煌潭鹊南嚓P性。因此，深入分析感病前后不同時期寄主植物體內(nèi)的生理生化變化，有助于進一步了解寄主植物的抗病機制、病害的發(fā)生規(guī)律和影響因素。

目前，獼猴桃栽培品種大多數(shù)通過人工雜交、嫁接等方式選育所得，初期抗病性表現(xiàn)良好，后來在栽培管理技術、病蟲害的多樣性和環(huán)境條件等因素的影響下，抗病性逐漸減弱，受病蟲害影響逐漸加重。我國擁有豐富的野生獼猴桃資源，許多野生獼猴桃的生物學特性、抗性、遺傳多樣性等特點還未被完全挖掘出來，野生獼猴桃資源還具有較大的利用和發(fā)展空間。因此，為充分利用我國豐富的野生獼猴桃資源，以篩選出的抗?jié)儾∫吧J猴桃為砧木、不同抗性水平的常見獼猴桃材料為接穗，分析感染Psa 病原菌后各嫁接組合對潰瘍病的抗性情況及生理生化指標與病情指數(shù)的關系，篩選影響潰瘍病發(fā)生的主要因素、最優(yōu)組合及抗病性相關的主要生理生化指標，為今后獼猴桃潰瘍病的防治、野生獼猴桃資源的利用以及抗病性分析提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗地位于西南林業(yè)大學溫室大棚內(nèi)（25°04′N、102°45′E），該地年平均氣溫為14.5 ℃，平均海拔為1 890 m，年降水量為1 031 mm，年日照時數(shù)為2 327.5 h，年蒸發(fā)量為1 856.4 mm，夏季多大風天氣，相對濕度為74%，土壤為紅壤土，屬北亞熱帶氣候類型，試驗地光照充足，通風和排水良好。

試驗所用砧木是從云南省不同地區(qū)采集的抗?jié)儾∫吧J猴桃，均為3年生實生苗，詳細信息見表1。

表1 砧木信息Tab.1 Rootstocks information

試驗所用接穗（表2）為云南省獼猴桃種植產(chǎn)業(yè)中種植面積較大、范圍較廣的3個主栽品種紅陽、貴長、Hort16-A 以及西南林業(yè)大學林學院森林培育與利用課題組通過Hort16-A 種子繁殖選育得到的植株（簡稱：Hort16-A種子繁殖植株），穗條均采用1年生健壯枝條。接穗和砧木均按病原菌接種流程進行過抗性分析，得到與其他研究者一致的結(jié)果[15-16]，詳細信息見表1—2。

表2 接穗信息Tab.2 Scions information

1.2 試驗設計

試驗設計4個因素，分別為砧木、接穗、Psa病原菌菌液濃度和接種方式；每個因素設計4 個水平，Psa 病原菌菌液濃度分別為5×105、5×106、5×107、5×108cfu/mL，接種方式分別為注射接種、創(chuàng)傷接種、針刺接種、無傷接種（表3）。其中，注射接種：用注射器直接將Psa 病原菌菌液注射到枝干韌皮部內(nèi)；創(chuàng)傷接種：用刀片去除枝干約0.5 cm2的韌皮部，用浸過Psa病原菌菌液的脫脂棉覆蓋傷口；針刺接種：用接種針在枝條韌皮部上刺6～8 個孔，用浸過Psa 病原菌菌液的脫脂棉覆蓋傷口；無傷接種：用浸過Psa病原菌菌液的脫脂棉覆蓋無損傷的枝條。嫁接成活6 個月后選擇距離土壤5 cm 處枝干接種。試驗采用L16（44）正交試驗設計（表4）。每組合3次重復，每次重復10 株嫁接苗，接種時每株嫁接苗的Psa 病原菌菌液接種量均為10 μL，接種完成后用保鮮膜包裹接種部位保濕24 h，然后揭去保鮮膜。

表3 試驗的因素和水平Tab.3 Factors and levels of the experiment

表4 L16（44）正交試驗設計Tab.4 L16（44）orthogonal experimental design

1.3 測定項目及方法

接種前，采集健康植株的葉片；接種后10、20、30、40 d，調(diào)查各處理的發(fā)病情況、發(fā)病部位、發(fā)病株數(shù)，并采集發(fā)病植株葉片。每個組合根據(jù)其重復次數(shù)，采集3 份混合樣。所取樣品均用液氮處理后置于-80 ℃保存，用于POD、PPO、SOD 活性及可溶性糖、脯胺酸、丙二醛含量的測定。其中，SOD 活性采用氮藍四唑法測定[17]，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[18]，PPO 活性采用鄰苯二酚法測定[19]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[20]，脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定[21]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[22]。

1.4 抗?jié)儾》治?/h3>

根據(jù)采集的數(shù)據(jù)，結(jié)合彭小列等[23]、李淼等[24]的研究方法，參照裴艷剛等[25]、涂美艷等[26]和石志軍等[13]抗?jié)儾〉燃墑澐謽藴蔥高抗（HR）：病情指數(shù)＜10；R：10≤病情指數(shù)＜30；T：30≤病情指數(shù)＜50；S：50≤病情指數(shù)＜80；高感（HS）：病情指數(shù)≥80]，對各組合的抗病性進行分級，篩選出抗病性較強的組合。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0、Excel 2021 等軟件進行方差分析和相關性分析，采用Origin 22.0 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫁接組合對獼猴桃潰瘍病的抗性分析

從表5 可知，接種Psa 病原菌后10 d 植株開始發(fā)病，各處理發(fā)病程度呈現(xiàn)出差異，發(fā)病最嚴重的是T13處理，其次為T8處理，T15處理未出現(xiàn)發(fā)病植株；后期各處理病情指數(shù)隨接種時間的延長逐漸增大。由于接種初期發(fā)病不明顯，中期波動幅度太大，直至接種40 d 后發(fā)病才趨于平穩(wěn)，因此，以40 d病情指數(shù)作為評價數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)T4、T6、T9、T15 處理表現(xiàn)為高抗，T12、T16 處理表現(xiàn)為抗病，T8、T11、T13、T14 處理表現(xiàn)為感病。其中，無傷接種處理（T4、T6、T9、T15）均為高抗，創(chuàng)傷接種處理（T2、T8、T11、T13）表現(xiàn)為耐病或感病，病情指數(shù)均大于無傷接種處理；以高感材料紅陽獼猴桃作接穗的處理T1、T5 表現(xiàn)為耐病，T9 表現(xiàn)為高抗，T13 表現(xiàn)為感病，有效提高了紅陽獼猴桃的抗病性。綜上，傷口是引起植株發(fā)病的主要因素，抗病砧木可以有效增強接穗抗性。

表5 不同嫁接組合對獼猴桃潰瘍病的抗性分析Tab.5 Analysis of resistance of different kiwifruit grafting combinations to canker

2.2 影響獼猴桃潰瘍病病情指數(shù)的關鍵因素及最優(yōu)組合分析

在獼猴桃潰瘍病發(fā)病過程中，病情指數(shù)是驗證植株發(fā)病嚴重度的重要指標[14]。本研究采用極差分析影響病情指數(shù)的主次因素。由表6 可知，不同接種后時間，接種方式（D）均為影響病情指數(shù)的主要因素。其中，接種后10 d，不同因素對病情指數(shù)的影響程度表現(xiàn)為D＞A＞C＞B，最優(yōu)組合為A1B3C2D4；接種后20 d，不同因素對病情指數(shù)的影響程度表現(xiàn)為D＞C＞A＞B，最優(yōu)組合為A1B3C1D4；接種后30 d，不同因素對病情指數(shù)的影響程度表現(xiàn)為D＞C＞B＞A，最優(yōu)組合為A1B3C1D4；接種后40 d，不同因素對病情指數(shù) 的 影 響 程 度 表 現(xiàn) 為D＞C＞B＞A，最 優(yōu) 組 合 為A1B3C1D4。綜上，抗?jié)儾〉淖顑?yōu)組合是A1B3C1D4。

表6 不同因素水平間獼猴桃潰瘍病病情指數(shù)的極差分析Tab.6 Range analysis of disease index of kiwifruit canker among different levels of different factors

續(xù)表6 不同因素水平間獼猴桃潰瘍病病情指數(shù)的極差分析Tab.6（Continued）Range analysis of disease index of kiwifruit canker among different levels of different factors

2.3 接種Psa病原菌對不同獼猴桃嫁接組合葉片生理生化指標的影響

2.3.1 保護酶活性

2.3.1.1 POD活性 圖1顯示，接種Psa病原菌后0～40 d，各處理獼猴桃葉片中的POD 活性總體上均隨著接種后時間的推進呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在接種Psa 病原菌后0～20 d，隨著接種后時間的推進，各處理POD 活性快速上升，20 d 時達到峰值，總體上高抗和抗病組合POD 活性上升幅度明顯高于耐病和感病組合，其中，20 d 時上升最快的高抗組合T15 POD 活性比感病組合T8 提高了65.95%；在接種Psa 病原菌后20～40 d，隨著接種后時間的推移，各處理POD 活性呈下降趨勢，到40 d時，高抗組合（T4、T6、T9、T15）分別比峰值時下降了69.16%、58.51%、72.76%、67.61%，而感病組合（T8、T11、T13、T14）分別比峰值時下降了39.24%、50.39%、65.56%、77.02%。

圖1 接種Psa病原菌對不同獼猴桃嫁接組合葉片POD活性的影響Fig.1 Effect of inoculation of Psa on POD activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表7可知，接種Psa病原菌后10～40 d，獼猴桃葉片中的POD 活性與潰瘍病病情指數(shù)存在極顯著負相關關系，相關系數(shù)分別為-0.905、-0.774、-0.879和-0.994。說明接種Psa 病原菌后，獼猴桃植株可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)POD 活性來抵御Psa 病原菌的侵害，提高自身抗病性。

表7 獼猴桃葉片POD活性與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.7 Correlation analysis between POD activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.1.2 SOD活性 圖2顯示，接種Psa病原菌后0～40 d，隨著接種后時間的推進，各處理獼猴桃葉片中的SOD 活性總體上均呈先上升后下降的趨勢。其中，高抗處理（T4、T6、T9、T15）和抗病處理（T12 和T16）SOD 活性上升較快，于接種后20 d 到達峰值；而耐病處理（T1、T2、T3、T5、T7、T10）和感病處理（T8、T11、T13、T14）上升較慢，于接種后30 d到達峰值，高抗和抗病處理SOD 活性上升幅度大于耐病和感病處理。

圖2 接種Psa病原菌對不同獼猴桃嫁接組合葉片SOD活性的影響Fig.2 Effect of inoculation of Psa on SOD activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表8可知，接種Psa病原菌后10～40 d，獼猴桃葉片中的SOD 活性與潰瘍病病情指數(shù)存在極顯著或顯著負相關關系，相關系數(shù)分別為-0.842、-0.785、-0.541、-0.651，接種前期相關性更強。說明當植株受到Psa 病原菌侵害時，可以通過調(diào)節(jié)SOD 活性來提高自身抗病性。

表8 獼猴桃葉片SOD活性與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.8 Correlation analysis between SOD activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.1.3 PPO 活性 圖3 顯示，接種Psa 病原菌后，隨著時間推進，各處理獼猴桃葉片中的PPO 活性總體上均呈先上升后下降的趨勢。高抗處理（T4、T6、T9、T15）、抗病處理（T12 和T16）和耐病處理（T1、T2、T3、T5、T7、T10）PPO 活性在被病原菌侵染后快速上升，接種后10 d達到峰值，其中，高抗處理T4上升速度最快，較0 d 時上升了166.06%；感病處理（T8、T11、T13、T14）上升相對緩慢，于接種后20 d到達峰值，分別較接種前上升66.14%、40.42%、11.41%、12.11%?？傮w上，高抗和抗病處理PPO活性上升幅度大于耐病和感病處理。到達峰值后所有處理PPO 活性均開始下降，并逐漸趨于平穩(wěn)，其中下降幅度最大的T2處理，比峰值時下降了69.42%。

圖3 接種Psa病原菌對不同獼猴桃嫁接組合葉片PPO活性的影響Fig.3 Effect of inoculation of Psa on PPO activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表9 可知，接種Psa 病原菌后10、20、40 d，獼猴桃葉片中的PPO 活性與潰瘍病病情指數(shù)均呈極顯著或顯著負相關關系，接種后10 d 的相關系數(shù)為-0.836，接種后20 d 和40 d 的相關系數(shù)分別為-0.576 和-0.585；而接種后30 d 時相關系數(shù)僅為-0.221，相關性不明顯?？傮w上說明當植株受到Psa 病原菌侵害時，可以通過調(diào)節(jié)PPO 活性來提高自身抗病性。

表9 獼猴桃葉片PPO活性與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.9 Correlation analysis between PPO activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.2 可溶性糖含量 圖4 顯示，接種Psa 病原菌后，隨著時間的推進，各處理獼猴桃葉片中可溶性糖含量總體上均呈先上升后下降的趨勢。在接種10～30 d 時，抗感病處理可溶性糖含量均呈上升趨勢，抗病處理可溶性糖含量增加較慢，感病和耐病處理增加量明顯高于抗病處理，之后呈緩慢下降的趨勢。

圖4 病原菌接種處理對不同獼猴桃嫁接組合葉片可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on soluble sugar content of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表10 可知，接種Psa 病原菌后10～40 d，獼猴桃葉片中的可溶性糖含量與潰瘍病病情指數(shù)均存在極顯著負相關關系，相關系數(shù)分別為-0.686、-0.724、-0.885 和-0.876。說明當植株受到Psa 病原菌侵染時，可以通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量來提高自身抗病性。

表10 獼猴桃葉片可溶性糖含量與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.10 Correlation analysis between soluble sugar content of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.3 脯氨酸含量 圖5 顯示，接種Psa 病原菌后，隨著時間的推進，獼猴桃葉片中脯氨酸含量總體上均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，高抗和抗病處理脯氨酸含量較耐病和感病處理增加快，提高幅度大。說明在植物受到Psa 病原菌侵害時，體內(nèi)均能產(chǎn)生脯氨酸來調(diào)節(jié)滲透平衡，但抗病植株產(chǎn)生的脯氨酸更多。

圖5 病原菌接種處理對不同獼猴桃嫁接組合葉片脯氨酸含量的影響Fig.5 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on proline content of different kiwifruit

由表11 可知，接種Psa 病原菌后10～40 d，獼猴桃葉片中脯氨酸含量與潰瘍病病情指數(shù)均存在極顯著或者顯著負相關關系，相關系數(shù)分別為-0.650、-0.518、-0.806、-0.738，說明脯氨酸含量與植株的抗病性相關，可以作為抗性評價的生理指標。

表11 獼猴桃葉片脯氨酸含量與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.11 Correlation analysis between proline content of leaves and disease index of different kiwifruit grafting combinations canker

2.3.4 丙二醛含量 圖6 所示，接種Psa 病原菌后，各處理獼猴桃葉片中丙二醛含量均呈現(xiàn)上升趨勢，感病處理T8、T11、T13 和T14 丙二醛含量上升幅度較大，以T14 處理上升幅度最大，40 d 時T14 處理的丙二醛含量比0 d 時增加了0.84 μmol/g，而其余處理丙二醛含量變化幅度較平緩?？傮w上，感病處理丙二醛含量高于耐病處理，耐病處理高于抗病處理，且增加幅度也明顯提高。說明接種Psa 病原菌后，抗病植株的膜脂過氧化程度較感病植株低。

圖6 病原菌接種處理對不同獼猴桃嫁接組合葉片丙二醛含量的影響Fig.6 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on malondialdehyde content of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表12 可知，接種Psa 病原菌后10～40 d，獼猴桃葉片中丙二醛含量與病情指數(shù)均存在極顯著正相關關系，相關系數(shù)分別為0.509、0.546、0.785 和0.904，說明病情指數(shù)越大，丙二醛含量越高，丙二醛含量可以作為抗病性評價的生理指標。

表12 獼猴桃葉片丙二醛含量與潰瘍病病情指數(shù)間的相關性分析Tab.12 Correlation analysis between malondialdehyde content of leaves and disease index of kiwifruit canker

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著獼猴桃商業(yè)化種植面積的不斷擴大、種植年限的延長，品種特性退化，提高栽培品種的抗病性、挖掘抗病資源、尋找抗性砧木、豐富砧木種類，是今后獼猴桃種植管理過程中需研究的熱點問題?？紤]到優(yōu)良砧木對適宜接穗的抗性、結(jié)果特性、果實品質(zhì)等方面的影響，本研究以抗?jié)儾∫吧J猴桃為砧木、常規(guī)栽培獼猴桃品種及Hort16-A種子繁殖植株為接穗，研究了Psa 病原菌濃度和植株傷口的有無對獼猴桃潰瘍病病情指數(shù)的影響。結(jié)果表明，接種方式為引發(fā)潰瘍病的主要因素，其中創(chuàng)傷接種后各處理病情指數(shù)最大，說明日常管理過程中，植株的自然孔口和機械損傷是潰瘍病菌侵染植株的主要渠道，在栽培過程中應避免獼猴桃植株受損傷，如果受損后應加強對植株機械損傷部位的消毒和殺菌處理，從而減輕潰瘍病的發(fā)生。另外，本研究篩選得到最優(yōu)組合A1B3C1D4（昭通獼猴桃為砧木、貴長獼猴桃為接穗、Psa病原菌菌液濃度5×105cfu/mL、無傷接種），說明抗病砧木可以有效改善接穗的抗病性，活體接種病原菌時選擇適宜的接種濃度也比較重要，以試驗篩選出的菌液濃度5×105cfu/mL對活體植株進行接種研究較適宜。

研究發(fā)現(xiàn)，SOD、POD 和PPO 活性均與植物抗逆性相關[27-29]。本研究結(jié)果表明，受潰瘍病菌侵染后各處理獼猴桃葉片中SOD、POD 和PPO 活性總體均呈現(xiàn)出先上升到一個峰值后又緩慢下降的趨勢，SOD 活性結(jié)果與其他植物受到逆境脅迫時的變化趨勢一致[30-32]，但POD 活性結(jié)果稍有不同[33-34]，可能與病原菌種類和處理時間有關。

目前，關于可溶性糖含量與植物抗病性關系的研究較多，但針對不同的病害、不同的寄主植物以及不同病原菌，研究者們得出的結(jié)果并不一致[30，35-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，在未接種Psa 病原菌前抗病植株的可溶性糖含量高于感病植株，接種Psa 病原菌后所有植株可溶性糖含量均增加，但是抗病植株可溶性糖含量增加緩慢，增加幅度小，感病植株可溶性糖含量快速增加，增加幅度大于抗病植株，這與鐘程操[37]、李靖等[30]研究結(jié)果相似，但與石志軍等[13]研究結(jié)果相悖，有待今后進一步深入研究。脯氨酸在植物的抗逆反應中，可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、能源物質(zhì)等，其含量可以作為植物抗病性評價指標[35]。本研究抗感病處理間獼猴桃葉片中脯氨酸含量的增長速度存在差異，抗病處理葉片中脯氨酸含量增加速度明顯快于感病處理，且脯氨酸含量與病情指數(shù)呈顯著或極顯著負相關，該結(jié)果與高寧馨等[36]在油菜抗菌核病研究中得出的脯氨酸含量與品種抗病性關系一樣。丙二醛是植物膜脂過氧化產(chǎn)物，丙二醛含量能夠較好地反映植物受損傷的程度[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種Psa 病原菌后，感病處理獼猴桃葉片中丙二醛含量快速增加，抗病處理丙二醛含量增加的速度較感病品種緩慢，說明抗病處理膜脂過氧化程度低，受損傷小。