裸花紫珠調(diào)控IGF-1/PI3K/Akt信號通路對糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的影響

李吉慶 林道斌 張永杰 陳學(xué)武

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬海南省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 ?？?570200)

糖尿病足潰瘍(DFU)是糖尿病的并發(fā)癥之一，及時(shí)對DFU干擾醫(yī)治，可以有效降低肢體壞死和膿毒血癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。然而，DFU治療缺乏特效藥物，在DFU發(fā)生早期促進(jìn)創(chuàng)面愈合仍是臨床上亟待解決的難題〔2〕。裸花紫珠在海南黎族區(qū)域較多，是海南傳統(tǒng)民族藥材，性味苦、微辛、平，具備散瘀、止血、解毒、消腫等功效。據(jù)研究，裸花紫珠的主要化學(xué)成分包括黃酮類化合物、揮發(fā)油、酚萜類等〔3〕，此外有研究顯示，裸花紫珠對創(chuàng)傷性傷口具有抗炎、止血和加速傷口愈合的作用〔4，5〕。有研究證明，胰島素樣生長因子(IGF)-1/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路影響DFU創(chuàng)面愈合具有重要的作用，本研究探討裸花紫珠調(diào)控IGF-1/PI3K/Akt信號通路對DFU大鼠創(chuàng)面愈合的影響。

1 資料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器 超純水儀(上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰竟?；激光共聚焦成像體系、切片機(jī)、展片機(jī)、烤片機(jī)(德國徠卡公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(中國明美公司)；血糖儀及血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司)；Millpore-Q超純水器廣州東銳科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增儀(廣東精普實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料 裸花紫珠藥材購自海南省中醫(yī)院中藥房，檸檬酸鈉緩沖液、鏈脲佐菌素(STZ)均購自上海如吉生物科技有限公司，RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，PCR引物由云南一同實(shí)驗(yàn)教育科技有限公司合成。引物序列(5′-3′)為：IGF-1上游：GTCGATTCGTAGCGGTTCGGA，下游：TCGATAGTCAAGGAAGTTA；IGF-1R上游：GGATTATCGGTAGGCCCAA，下游：TTGGCTTAGGTTCGAACC；PI3K上游：CGATGGCCTTAACGAGGTTAA，下游：TGGTTACAAGGTTCAC；Akt上游：ACGGCATGTTGGGCGTACCAGCT，下游：TTGGTTAATCCTCAAGG；eNOS上游：GAGACAGCCGGGCTTA，下游：TGATCGTAGTGATGATGATAA；VEGFR2上游：TCACGTGGTACTTAGGACC，下游：CAAGCTTACGA-TTCCGC。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康SD大鼠48只，雌雄各半，體重(200±22)g，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0011。

1.4方法

1.4.1裸花紫珠水提物制備 裸花紫珠干燥、粉碎、過40目篩，加水浸泡2 h后加熱回流提取3次，加水量為藥物質(zhì)量10倍。在1 h后萃取1 h，在蒸發(fā)盤中取出過濾，并在水浴上蒸發(fā)后，在105℃下干燥24 h，干燥后快速冷卻半小時(shí)，得到提物。使用前用適量純凈水將藥物調(diào)勻。

1.4.2大鼠DFU模型制備及藥物干預(yù)方法 大鼠自適應(yīng)喂養(yǎng)1 w，將12只大鼠隨機(jī)選擇正常組，剩余的大鼠用作模型組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高糖高脂飼料(配料比例是雞蛋∶奶粉∶蔗糖∶豬油∶普通飼料為2∶5∶20∶15∶58)喂養(yǎng)4 w。

4 w后，禁食不禁水12 h，正常組一次性腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，模型組腹腔注1%STZ(45 mg/kg，由pH4.5的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液配制)創(chuàng)建糖尿病大鼠模型。注后3 d測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功〔2〕，若失敗則再次腹腔注射1%STZ溶液(10 mg/kg)，維持高血糖狀態(tài)4 w。此外，為避免大鼠死亡，若大鼠血糖高于25 mmol/L則給予胰島素降糖。

造模成功后取36只模型大鼠及正常組12只大鼠給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，使用直徑為2.5 cm的打孔機(jī)器，使傷口在大鼠背面，深度到筋膜層〔2〕。創(chuàng)面造模成功后，所有大鼠常規(guī)消毒止血。分為正常組、模型組、凡士林紗布組、裸花紫珠治療組各12只。正常組及模型組給予生理鹽水紗布外敷治療，其余兩組則用相應(yīng)敷料紗布覆蓋創(chuàng)面治療。各組均在相應(yīng)敷料上層再覆蓋無菌紗布并在最外層給予繃帶包扎，每日換藥1次。藥物干預(yù)期間密切觀察大鼠情況，如有撕咬敷料或紗布，及時(shí)處理。治療期間大鼠均單籠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，室溫維持在22～25℃，濕度55%～65%，保持12 h光照，晝夜循環(huán)。

1.4.3大鼠創(chuàng)面愈合情況及創(chuàng)面病理學(xué)觀察 分別于給藥后3、7 d觀察創(chuàng)面愈合情況，包括創(chuàng)面顏色、組織腫脹程度及滲出液等。操縱相機(jī)攝影，用Photoshop處理相片，測算創(chuàng)面面積，根據(jù)公式：創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積-給藥后第n天創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面初始面積×100%，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。在上述觀察完成后，每組各隨機(jī)抽取6只大鼠，給予戊巴比妥鈉麻醉，采集創(chuàng)面及周圍2 mm的組織，一部分經(jīng)過4%多聚甲醛固定組織24 h后，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察創(chuàng)面及創(chuàng)周組織學(xué)變化，包括毛細(xì)血管、炎癥細(xì)胞、纖維細(xì)胞等。另一部分生理鹽水沖洗后，吸干水分后置于-80℃冰箱，待RT-PCR檢測。

1.4.4大鼠創(chuàng)面組織中IGF-1、IGF-1受體(IGF-1R)、PI3K、Akt、一氧化氮合酶(eNOS)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)2 mRNA表達(dá)水平檢測 應(yīng)用RT-PCR檢測組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平。首先按照試劑(盒)說明書步驟提取組織總RNA并測定其含量，以cDNA為模板擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)備變性 10 min；95℃變性 10 s，56℃退火 30 s，72℃蔓延30 s，40個循環(huán)，2-ΔΔct法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.4.5Western印跡檢測組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá) 干預(yù)后取各組創(chuàng)面組織提取蛋白定量后保存。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后分別用IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2的一抗室溫孵育2～3 h，用相應(yīng)的二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，最后超敏發(fā)光液顯色、曝光。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采取SPSS25.0軟件單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 開始喂食高脂高糖飼料至注射STZ溶液前，兩組毛色光滑明亮，飲食、活動均正常，第1周至第4周模型組體重較正常組明顯增長(P<0.05)，注射STZ溶液后，第5周兩組體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，第6～8周模型組體重較正常組明顯下降(P<0.05)。見表1。注射STZ溶液后，模型組毛色逐漸枯黃、雜亂，皮下脂肪減少，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿等現(xiàn)象，模型組與對照組注射后第3天血糖為〔(22.63±1.46)、(5.76±1.14)mmol/L〕，注射STZ前為〔(5.93±1.12)、(6.01±0.96)mmol/L〕，模型組注射STZ前后血糖存在顯著差異(P<0.05)，而正常組一般情況無明顯變化(P>0.05)。

2.2各組創(chuàng)面愈合率 治療后第3天和第7天，模型組的創(chuàng)面愈合率均明顯低于正常組，其中第3天凡士林紗布組、裸花紫珠組顯著高于模型組(P<0.05)。第7天凡士林紗布組較模型組愈合率明顯增高，而裸花紫珠組顯著高于凡士林紗布組及模型組(P<0.01)。見表2。

表1 兩組體重變化

表2 各組創(chuàng)面愈合率比較

2.3各組創(chuàng)面組織病理學(xué)對比 治療后第3天，正常組較多炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)有少量毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長；裸花紫珠組有較少炎癥細(xì)胞浸潤，有少量毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長；凡士林紗布組有較多炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)有少量纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管；模型組有少量炎癥細(xì)胞浸潤和纖維細(xì)胞生長，并沒有顯著的新毛細(xì)血管。治療后第7天，正常組有較多炎癥細(xì)胞浸潤，纖維細(xì)胞生長活躍，毛細(xì)血管數(shù)量較前增加；裸花紫珠組可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管生長活躍；凡士林紗布組有較多炎癥細(xì)胞浸潤，纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管數(shù)量增加；模型組可見較多炎癥細(xì)胞，有少量纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管。見圖1。

圖1 各組組織病理學(xué)(HE染色，×400)

2.4各組創(chuàng)面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá) 干預(yù)后第3和7天，正常組、凡士林紗布組及裸花紫珠組創(chuàng)面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)均較模型組明顯升高，且正常組及裸花紫珠組明顯高于凡士林紗布組(P<0.05)。見表3、表4、圖2。

表3 各組創(chuàng)面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平

表4 各組創(chuàng)面組織中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平

1～4:正常組、模型組、凡士林紗布組、裸花紫珠組圖2 Western印跡檢測各組創(chuàng)面組織、IGF-1、 IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGF2蛋白

3 討 論

世界上大約有3.82億成年人患有糖尿病，約1.25%的足部糖尿病潰瘍可能導(dǎo)致截肢〔6〕。DFU常由外周腎病和外周血管疾病的缺血而發(fā)生，其治療主要包括清創(chuàng)及愈合過程〔7,8〕。DFU在中醫(yī)中屬于“脫疽”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，該病的關(guān)鍵病機(jī)在于氣血不足致新肉難生，故治療關(guān)鍵為“祛瘀生新”〔9〕?，F(xiàn)代研究顯示，新生血管能為創(chuàng)面的愈合提供必要的血氧供應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面組織生長，所以增加創(chuàng)面組織中新生毛細(xì)血管的數(shù)量是治療本病的關(guān)鍵〔2〕。裸花紫珠顆粒的主要成分為中藥裸花紫珠，系馬鞭草科植物裸花紫珠的葉內(nèi)含縮合鞣酸、酚類等，能明顯抑制多種致病微生物，還能使毛細(xì)血管通透性降低、收縮血管，能明顯的抑制炎癥滲出及腫脹；據(jù)報(bào)道，一些化合物可以顯著縮短小鼠的出血、凝血時(shí)間，可以通過內(nèi)源性凝血途徑〔10〕。本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果提示，經(jīng)裸花紫珠提取物外敷治療后，DFU模型大鼠創(chuàng)面組織血管生成旺盛。而根據(jù)RT-PCR研究結(jié)果，裸花紫珠促進(jìn)血管生成的機(jī)制可能與IGF-1/PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

VEGF是一種可通過提高活化因子和抑制因子-l的表達(dá)，提高血漿酶原活化因子的活性，促進(jìn)蛋白水解，進(jìn)而加速新生毛細(xì)血管的形成的高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子〔11〕。IGF-1是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素近似的多肽蛋白?？赏ㄟ^誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，推動創(chuàng)面組織修復(fù)〔12〕。研究顯示，IGF-1在糖尿病患者體內(nèi)濃度低下，是DFU創(chuàng)面難以愈合的重要原因〔13〕。 創(chuàng)面愈合的過程除了需要各種細(xì)胞和細(xì)胞因子進(jìn)行參與之外，還有必要通過復(fù)雜的信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種基因的表達(dá)，PI3K/Akt 信號通路是與細(xì)胞生長密切相關(guān)的信號途徑，該信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡方面具有重要作用〔14〕。研究表明，糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)生與 IGF-1 密切相關(guān)，IGF-1 能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和分化，有效增加胞外基質(zhì)如膠原、聚葡萄糖胺、纖粘連蛋白等合成及分泌。機(jī)體長期處于高糖狀態(tài)使 IGF-1 的表達(dá)減少，影響潰瘍修復(fù)。而因 IGF-1R 對 IGF-1 的高親和力，可通過檢測 IGF-1R 來提示 IGF-1 的表達(dá)情況〔15〕。據(jù)研究顯示，IGF-1能特異性結(jié)合IGF-1R激活PI3K/Akt信號通路〔16〕，進(jìn)而磷酸化多種激活因子如eNOS〔17〕，參與血管生成的各個環(huán)節(jié)。同時(shí)磷酸化的Akt能提高VEGF主要功能受體VEGFR2的表達(dá)，增強(qiáng)VEGF的生物學(xué)活性〔18〕。本研究結(jié)果提示，裸花紫珠可能通過調(diào)控IGF-1/PI3K/Akt信號通路，增加組織中VEGFR2釋放，達(dá)到促進(jìn)血管生成的目的。

綜上，裸花紫珠對于DFU具有良好的治療作用，大多是通過調(diào)節(jié)IGF-1/PI3K/Akt信號通路來上調(diào)組織中的基因表達(dá)水平，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和新生兒毛細(xì)血管增殖，改善傷口的血液循環(huán)，使上皮細(xì)胞加速生長，最終有效促進(jìn)傷口組織修復(fù)，可作為DFU外用配方進(jìn)行深入研究。