白藜蘆醇對炎癥型腸應激綜合征小鼠腸上皮屏障功能的作用*

馮楊焜，侯道榮，顧正宇

1 南通大學醫(yī)學院 江蘇南通 226001

2 南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心 江蘇南京 211166

3 江蘇省南京市紅十字醫(yī)院 江蘇南京 210001

胃腸感染患者會出現(xiàn)會腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）癥狀[1-3]。IBS 是功能性胃腸疾病的一種主要形式，影響世界11.2%的人口[4]，其癥狀是腹痛和腹脹、內(nèi)臟痛過敏和腸運動異常。這種癥狀此后會發(fā)展為炎癥后腸易激綜合征（Post inflammatory irritable bowel syndrome，PI-IBS），表現(xiàn)為盡管明顯的腸道損傷已恢復，但患者仍遭受疼痛和不適。對結(jié)腸機械刺激（平滑肌收縮、管腔接觸或腸道膨脹）的超敏感是一個重要特征[5]。IBS患者除了胃腸道疾病外，心理疾病的發(fā)生率也很高。功能性消化不良、胃食管反流病與抑郁焦慮在腸易激綜合征患者中普遍存在[6]，這是因為受到腦-腸軸功能障礙的影響[7]。腦-腸軸的作用是監(jiān)測腸道（回腸和結(jié)腸）功能，并將大腦皮層和海馬體等大腦情緒中心與腸道外周功能如腸道動力和腸內(nèi)分泌信號聯(lián)系起來。最近的研究表明，外周超敏反應信號會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而引發(fā)抑郁或焦慮，進而影響內(nèi)臟敏感性并引起腸道運動功能障礙[6]。目前對IBS類似癥狀的治療主要集中在腸道和內(nèi)臟疼痛上[8]，但效果并不理想。因此，針對腦-腸軸的治療理念越來越值得關注[9]。

腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持需要完整的上皮屏障將腸壁與存在于腸腔內(nèi)的有害細菌隔離。腸上皮屏障紊亂可使管腔內(nèi)容物不受約束地進入粘膜，激活粘膜免疫反應[10]，進而影響分泌、吸收和運動等腸道功能[11]。事實上，越來越多的證據(jù)表明腸上皮屏障破壞是一種潛在的致病機制，其與PI-IBS的發(fā)病或發(fā)展有關[12]。近年來，參與上皮屏障功能調(diào)節(jié)的介質(zhì)研究引起了廣泛關注。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種[13]，已被證實在幾個發(fā)育和成熟的外周組織中表達，包括胃腸道、多條血管和牙周組織[14]。多項研究表明，神經(jīng)細胞分泌的各種可溶性因子，包括神經(jīng)生長因子（NGF）、BDNF和神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，可能對維持血神經(jīng)屏障的完整性或通透性和改變緊密連接分子至關重[15]。

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然多酚，存在于紅酒、葡萄皮和結(jié)縷草中[16]。它具有許多生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護效應[17]。越來越多的證據(jù)表明，在許多疾病動物模型中發(fā)現(xiàn)RES的抗抑郁和抗焦慮特性與神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關[18]。最近的研究還表明RES能夠調(diào)節(jié)腦和腸道中BDNF的表達[19]。三硝基苯磺酸（TNBS）是炎癥型IBS模型中常用的藥物，在IBS機制研究中得到了廣泛的應用[19-20]。IBS動物模型可以在很大程度上從中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂到腸動力和內(nèi)臟知覺障礙模擬IBS的癥狀[21]。因此，本研究擬通過使用2，4，6 -三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的炎癥型小鼠腸應激綜合征（PI-IBS）模型，探究RES在調(diào)節(jié)PI-IBS小鼠腸上皮屏障功能和內(nèi)臟敏感性中的作用和機制。

資料與方法

1 實驗動物

8w SPF級C57BL/6雄性小鼠30只，購于南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心。實驗動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0002。動物自由飲食并置于恒定環(huán)境[溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜循環(huán)光照 ]下飼養(yǎng)，實驗動物倫理編號為：IACUC-2206022。

2 主要試劑

白 藜 蘆 醇（貨 號：R817263，Cas號：501-36-0，純度≥99%）購自上海麥克林生物有限公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，P2297）購自美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自上海博蘊生物科技有限公司；PKA抗體（ab76238）、BDNF抗體（ab108319，）、兔抗 ZO-1 抗體（ab221547）、Occludin抗體（ab216327），Claudin-2抗體（ab53032），羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗（ab7090）和羊抗鼠HRP偶聯(lián)二抗（ab97040）購自英國Abcam公司；p-CREB（06-519）和CERB抗體（06-863）購自Millipore公司；GAPDH 兔單克隆抗體（A19056）購自中國Abclonal公司。

3 主要儀器

顯微鏡（Bx51），日本Olympus公司；小型垂直電泳槽（1658001），美國Bio-Rad公司；電泳儀電源（DYY-6C），北京市六一儀器廠；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi-Doc XRS+Molecular Imager），美國 Bio-Rad 公司。

4 方法

4.1 PI-IBS小鼠造模 參考Hughes PA等的方法建立PI-IBS小鼠模型[20]。小鼠1%戊巴比妥鈉麻醉后，從肛門插入插入聚乙烯導管至3厘米處，然后單次直腸內(nèi)給藥TNBS 0.1 mL（溶于30%乙醇，終濃度為130 mg/mL）誘發(fā)結(jié)腸炎。小鼠結(jié)腸炎27天后恢復，28天后進行實驗。

4.2 分組與干預 使用隨機數(shù)字表法將30只雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組，每組10只。Control組（對照組）：小鼠按體質(zhì)量（0.5 mL/100 g）灌胃 0.5%CMC-Na[19]；PI-IBS組（模型組）：使用 TNBS進行小鼠PI-IBS造模27天后用于實驗；PI-IBS+RES組（治療組）：造模后，每天1次40mg/kg白藜蘆醇灌胃處理[18，22，23]。白藜蘆醇溶于 0.5% CMC-Na 中，于給藥當天稀釋至所需濃度。

4.3 糞便排出量測定 誘導結(jié)腸炎后第28天，將小鼠單獨置于代謝籠中，收集2 h糞便樣本并稱重。將收集的糞便樣本置于干燥器中，加熱6 h后稱重。記錄糞便總濕重和總干重。糞便含水率按以下公式計算：糞便含水率（%）=（濕糞重－干糞重）/濕糞重×100%。將糞便顆粒數(shù)記為排便次數(shù)。

4.4 腹 壁 回 撤 反 應（abdominal withdrawal reflex，AWR）評分 采用AWR評分評價小鼠內(nèi)臟敏感程度。參考文獻方法[20，23]，具體實驗過程如下：小鼠禁食不禁水24 h后，經(jīng)肛門插入帶氣囊的導管，待適應后開始檢測。達到目標壓力后持續(xù)20 s，評分后壓力回至零點，氣囊內(nèi)壓力由 20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）開始，每隔 5 min 分別遞增至 40、60、80 mmHg，根據(jù)AWR進行評分[24]：0分，結(jié)腸擴張時無反應；1分，結(jié)腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少；2分，結(jié)腸擴張時腹部肌肉收縮，但腹肌未抬離桌面；3分，結(jié)腸擴張時腹部肌肉收縮，腹肌抬離桌面；4分，結(jié)腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓形。

4.5 免疫組化 各組小鼠的遠端結(jié)腸組織中切取4 μm厚的切片。去除抗原后，用正常山羊血清封閉切片，并用ZO-1抗體和Occludin抗體4°C孵育過夜。用PBS清洗切片，室溫下二抗孵育2 h。用二氨基聯(lián)苯胺作顯色劑，然后用蘇木精復染，在光學顯微鏡下觀察拍照并使用 Image Pro Plus 6.0 軟件定量。

4.6 透射電鏡 將小鼠結(jié)腸組織剪成芝麻粒大小，在2.5%戊二醛中4℃固定48 h。隨后組織在0.5%四氧化鋨中后固定、脫水并浸入環(huán)氧樹脂。制作組織超薄切片（厚度：90 nm），并使用透射電子顯微鏡（Tecnai G2 Spirit Bio TWIN；FEI Ltd.）在 120 kV 加速電壓和15000放大倍數(shù)下進行檢查拍照。

4.7 蛋白免疫印跡（western blot） 蛋白免疫印跡檢測小鼠海馬體和結(jié)腸粘膜PKA、p-CREB、CREB、BDNF和Claudin-2表達。小鼠結(jié)腸黏膜組織裂解物50 ug經(jīng)十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜約4 h，然后用 PKA（1：500），p-CREB（1：500）、CREB（1：500）、BDNF（1：500）、和 Claudin-2（1：500）4℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌3次后，用HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1h。GAPDH為蛋白對照。在室溫下在封閉緩沖液中放置2 h，然后用Tris緩沖鹽水-Tween-20（TBST）沖洗膜3次，并用ChemiDoc XRS+分子成像儀成像。所有圖像均使用imagej1.42軟件圖像分析定量。

4.8 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）和t檢驗。

結(jié) 果

1 RES對PI-IBS小鼠糞便含水量和顆粒數(shù)的影響

與Control組小鼠比較，PI-IBS組小鼠糞便含水量 [（49.83±2.52）%]和 糞 便 顆 粒 數(shù)（6.78±0.32）顯 著 增 加（t=-9.2226，P=0.0007和t=-11.1935，P=0.0003；表1）；與 PI-IBS組小鼠比較，PI-IBS+RES組小鼠糞便含水量[（38.12±1.95）%]和糞便顆粒數(shù)（4.12±0.29）顯著增加（t=-3.7800，P=0.0030和t=-4.5197，P=0.0094；表1）。

表1 各組小鼠糞便含水量和顆粒數(shù)測定（±s，n=6）

表1 各組小鼠糞便含水量和顆粒數(shù)測定（±s，n=6）

注：與 Control組比較，*P< 0.05，**P< 0.05；與 PI-IBS 組比較，#P< 0.05，##P< 0.05

組別 糞便含水量/% 糞便顆粒數(shù)/個Control組 31.33±2.42 3.1±0.21 PI-IBS組 49.83±2.52* 6.78±0.32*PI-IBS+RES組 38.12±1.95*## 4.12±0.29*##

2 RES對PI-IBS小鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與 Control組 比 較，PI-IBS組 小 鼠 在 40、60、80 mmHg壓力直腸擴張下AWR評分明顯增高（t=-4.2758，P=0.0128，t=-5.2311，P=0.0064和t=-4.6552，P=0.0048；表2），表明實驗小鼠在誘導炎癥型腸應激綜合征后內(nèi)臟疼痛閾值下降，腸道敏感性增加；在給予RES治療后AWR評分不同程度降低，PI-IBS+RES組在 40、60、80 mmHg 壓力下均能明顯逆轉(zhuǎn) PI-IBS小鼠 AWR 評分增高現(xiàn)象（t=-2.5731，P=0.0391，t=-2.5733，P=0.0268和t=-0.7229，P=0.0168；表2），體現(xiàn)RES在一定程度上具有改善IBS大鼠腸道高敏狀態(tài)的作用。

表2 各組小鼠內(nèi)臟敏感性測定（±s，n=6）

表2 各組小鼠內(nèi)臟敏感性測定（±s，n=6）

注：與 Control組比較，*P< 0.05，**P< 0.05；與 PI-IBS 組比較，#P< 0.05，##P< 0.05

組別 20mmHg 40mmHg 60mmHg 80mmHg Control組 0.8±0.1 1.5±0.16 2.19±0.11 3.21±0.10 PI-IBS 組 1.19±0.14*1.98±0.12*2.64±0.14**3.63±0.15**PI-IBS+RES 組 1.12±0.11*1.74±0.08#2.38±0.09#3.27±0.11#

3 RES對小鼠結(jié)腸Occludin和ZO-1表達的影響

Occludin和ZO-1表達于小鼠結(jié)腸上皮袖口和隱窩中（圖1A）。定量分析結(jié)果表明，與Control組比較，PI-IBS小鼠的結(jié)腸粘膜中Occludin和ZO-1的表達顯著降低（t=14.2681，P=0.0001和t=-9.6747，P=0.0006；圖1B）；與 PI-IBS組比較，PI-IBS+RES小鼠的結(jié)腸粘膜中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達明顯升高（t=16.2278，P=0.0018和t=-5.2680，P=0.0046；圖1B）。

圖1 RES對小鼠結(jié)腸Occludin和ZO-1表達的影響

4 小鼠結(jié)腸粘膜透射電鏡觀察

各組小鼠結(jié)腸組織透射電鏡的結(jié)果顯示，Control組小鼠結(jié)腸組織上皮完整，微絨毛有序，緊密連接完整，線粒體完整，線粒體嵴清晰明顯（圖2A，B）。與Control組比較，PI-IBS小鼠的結(jié)腸組織上皮不完整，微絨毛紊亂，緊密連接不完整，線粒體嵴不明顯或消失。而與PI-IBS相比，白藜蘆醇治療（PI-IBS+RES組）顯著改善了結(jié)腸組織微絨毛、緊密連接和細胞器的病變（圖2A，B）。

圖2 透射電鏡檢測RES對小鼠結(jié)腸組織病變的作用

5 RES對小鼠結(jié)腸相關蛋白表達的影響

使 用 Western blot方 法 檢 測 RES 對 PI-IBS 小鼠結(jié)腸相關蛋白 PKA、p-CREB、CREB、BDNF和Claudin-2的表達（圖3A）。定量分析結(jié)果表明，與Control組比較，PI-IBS小鼠的結(jié)腸粘膜中PKA、p-CREB、BDNF和Claudin-2表達顯著升高（t=11.6532，P=0.0078，t=-3.5674，P=0.0084，t=4.5821，P=0.0091和t=-5.8659，P=0.0063；圖3A）；與 PI-IBS組 比較，PI-IBS+RES小鼠的結(jié)腸粘膜中PKA、p-CREB、BDNF和 Claudin-2的 表 達 顯 著 降 低（t=5.7685，P=0.0038，t=3.5236，P=0.0054，t=-5.8964，P=0.0032和t=6.3562，P=0.0260；圖3A）；而在海馬體中，與Control組比較，PI-IBS小鼠的海馬體中PKA、p-CREB和 BDNF表達顯著降低（t=5.5238，P=0.0047，t=3.6985，P=0.0056和t=4.6332，P=0.0023；圖3B）；與PI-IBS組比較，PI-IBS+RES小鼠的海馬體中PKA、p-CREB和BDNF的表達顯著增高（t=6.3221，P=0.0075，t=-7.2658，P=0.0092 和t=7.6954，P=0.0055；圖3B）

圖3 RES對小鼠結(jié)腸相關蛋白表達的影響

討 論

有研究表明多酚類化合物RES在情緒障礙疾病中的作用，其中有涉及神經(jīng)系統(tǒng)的保護[24]、抗抑郁[25]以及神經(jīng)退行性疾病的預防作用[26]等。腸屏障缺陷是和胃腸疾病（包括IBS）發(fā)生、惡化和隨后炎癥反應的重要原因[27]。鑒于IBS在腸道和精神情緒方面的病理特點與RES的藥理特點相吻合，本實驗探究了RES在調(diào)節(jié)PI-IBS小鼠腸上皮屏障功能和內(nèi)臟敏感性中的作用和機制。使用TNBS小鼠直腸內(nèi)給藥28天后（恢復期）形成PI-IBS模型，表現(xiàn)為腸粘膜屏障功能受損，腸道通透性增加，與對照組相比，PIIBS小鼠糞便含水量顯著增加；內(nèi)臟疼痛閾值下降，腸道敏感性增加；結(jié)腸粘膜中緊密連接（TJ）蛋白包括 Occludin和 ZO-1顯著降低，而 PKA、p-CREB、BDNF和Claudin-2表達明顯升高。而在小鼠海馬體，PKA、p-CREB、BDNF的表達模式與結(jié)腸完全相反。這一結(jié)果與Yu等人的實驗結(jié)果相似[19，24]，即RES可以逆轉(zhuǎn)腦和腸中BDNF的表達，通過調(diào)節(jié)腦-腸相互作用，維持腦-腸相互作用的穩(wěn)態(tài)。我們的結(jié)果證實RES能改善IBS癥狀，并且RES對炎癥誘導的小鼠海馬PKA、pCREB和BDNF表達的降低和結(jié)腸PKA、pCREB和BDNF表達的增高有一定的抑制作用。RES對IBS大鼠腦腸BDNF系統(tǒng)紊亂的調(diào)節(jié)作用與其參與PKA-CREB-BDNF信號調(diào)節(jié)有關[28]。臨床上，IBS-D患者腸黏膜BDNF表達也顯著上調(diào)[29]。BDNF在不同的損傷過程中上調(diào)：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF上調(diào)參與了多發(fā)性硬化病變的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)支持[30]；在血管系統(tǒng)，成年大鼠和人主動脈的新生內(nèi)膜血管平滑肌細胞中BDNF的表達顯著增加以應對血管損傷[31]，這一過程在新生內(nèi)膜形成過程中持續(xù)存在；這些結(jié)果說明BDNF在PI-IBS小鼠腸道屏障改變中具有病理生理的作用。

腸屏障缺陷被認為是隨后炎癥反應和重要胃腸疾?。òc易激綜合征）發(fā)生和惡化的關鍵步驟[27]。為了進一步探討RES調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能的機制，我們探究了RES和TJ蛋白的關系。我們證明RES通過調(diào)控BDNF對腸上皮屏障的調(diào)節(jié)與腸上皮細胞TJ蛋白表達的改變有關。TJ跨膜蛋白如Occludin、Claudin-1和支架蛋白ZO-1負責屏障的完整性[32]。本研究觀察到RES處理后結(jié)腸粘膜中Occlutdin和ZO-1的表達上調(diào)和Claudin-2表達下降。Claudin-2可增加上皮細胞對水的通透性，在孔道形成和維持腸黏膜屏障等方面發(fā)揮重要作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)IBS大鼠結(jié)腸組織Claudin-2表達增多，ZO-1等表達減少，腸黏膜屏障損傷[19]。由此可見，Claudin-2 等TJ 蛋白數(shù)量和結(jié)構(gòu)功能的改變，可導致腸上皮緊密連接損傷，引起腸黏膜屏障破壞，繼而引起腹瀉等癥狀的產(chǎn)生。臨床上，IBS-D患者的結(jié)腸和空腸中TJ蛋白Occludin、ZO-1、claudin-1、claudin-2的表達會發(fā)生改變，并伴有相應的腸屏障缺損[28]。本研究表明，在TNBS誘導的結(jié)腸炎后PI-IBS小鼠表現(xiàn)出腸屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與TJ蛋白的表達水平改變有關，這是IBS-D患者的共同特征[34]。

綜上，本研究表明RES 可通過調(diào)控PKA/CERB/BDNF信號從而調(diào)節(jié)結(jié)腸TJ蛋白的表達；顯著緩解PI-IBS小鼠腸粘膜屏障損傷。為RES用于PI-IBS臨床治療提供了實驗基礎和理論依據(jù)。