三葉青地上部分水溶性多糖的抗腫瘤作用研究*

龔來覲，李鶴

江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院 江西宜春 331200

三葉青 Tetrastigma hemsleyanum 為葡萄科崖爬藤屬蔓生植物，主要以塊根入藥。三葉青又名金線吊葫蘆、蛇附子、石抱子等，主產(chǎn)地為浙江、福建、江西等南方地區(qū)，其性涼，味微甘、辛，具有清熱解毒、消炎止痛、祛風(fēng)化痰等功效[1-2]。據(jù)報(bào)道，三葉青具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，三葉清塊根可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)各種癌細(xì)胞的凋亡[3]。廣泛用于白血病和肺癌、肝癌、胃癌的治療。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，乙醇提取的三葉清黃酮抗腫瘤和抗氧化作用[4]。然而，三葉清水煎劑在傳統(tǒng)民間醫(yī)學(xué)中被廣泛使用，三葉清水提物中的活性成分，包括多糖，仍然缺乏研究。此外，大多數(shù)研究集中于三葉青的塊根，從三葉青葉子中提取的多糖研究報(bào)告較少。為了開發(fā)藥用資源，本研究旨在從三葉清葉子中提取純化多糖，對其化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。并用H22荷瘤小鼠研究其抗腫瘤作用，對小鼠血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1 試劑與材料

腫瘤壞死因子α（TNF）a、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、干擾素 -γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素 -1β（IL-1β）和前列腺素E2（PGE2）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海新凡生物科技公司（中國上海）；BCA蛋白檢測試劑盒購自Beyotime biotechnology（中國上海）；脂多糖（LPS）購自美棉生物科技（中國江蘇鹽城）；本研究中使用的其他試劑為分析級(jí)試劑，本研究中使用的水是從默克Milli-Q水凈化系統(tǒng)獲得的去離子水。

三葉青的地上由江西大茅山中藥生物科技有限公司提供，經(jīng)江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院龔福保教授鑒定。

2 動(dòng)物

健康雄性昆明小鼠（22±2 g）、ICR 雄性小鼠（25±2 g）和 BALB/c雄性小鼠（22±2 g）購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠被安置在溫度為21～23°C、相對濕度為30%～70%、光照/暗照周期為12h的有機(jī)玻璃籠中，可以自由獲取食物和水。

3 三葉青地上部分多糖的制備與分析

3.1 多糖的提取與純化 取三葉青地上部分粉末250g，1000mL去離子水80℃提取三次，每次30min，合并，過濾，在4000r/min下離心20min，減壓濃縮，干燥得水溶性部分（WSP）。在濃縮液中加入三倍體積的95%乙醇，4℃放置12h。離心，將沉淀重新溶解在水中，并重復(fù)沉淀程序，凍干沉淀得到粗多糖。sevag法脫蛋，脫蛋白樣品上DEAE-Sepharose fastflow柱（2.6cm×30cm），用流速 1.0 mL/min 的 0.2mol/L 、0.5mol/L、1.0mol/L NaCl溶液逐步梯度洗脫。0.2moL/LNaCl溶液洗脫部分過Superdex-200（2.0cm×80cm）色譜柱，去離子水洗脫，獲得純化的多糖為三葉青多糖[5-7]。

3.2 均勻性和分子量測定[8-9]高效凝膠滲透法測多糖的均質(zhì)性和分子量，以分子量為5kDa、25kDa、50kDa、80kDa、150kDa的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)物用作標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記物；Waters1525（Waters Ultrahydrogel500 柱），蒸發(fā)光散射檢測器；流動(dòng)相：20mmoL/L醋酸銨溶液等度洗脫，樣品用流動(dòng)相溶解制備成1mg/mL的溶液，注射體積20μL。

3.3 化學(xué)性質(zhì)及單糖組成分析 氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）測定多糖的單糖組成，在密封試管中，100℃TFA水解多糖6h，添加甲醇將水解產(chǎn)物蒸發(fā)至干燥，以去除TFA。依次添加去離子水和四氫硼酸鈉（NaBH4）還原單糖3h。還原產(chǎn)物用醋酸酐中和并蒸發(fā)至干燥，然后用3mL吡啶和3mL醋酸酐在100℃下乙酰化1h。冷卻至室溫后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除多余的醋酸酐。乙酰化衍生物通過島津GC-MSQP2010進(jìn)行分析，色譜柱 HP-5毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25μm）。柱烘箱溫度以2℃/min的速率從120℃上升到200℃，并以10℃/min的速率進(jìn)一步上升到250℃。使用氦氣作為載氣，速率 1.0 mL /min。MS操作參數(shù)如下：電離能70eV；離子源溫度230℃；在掃描模式下收集數(shù)據(jù)。用保留時(shí)間和質(zhì)譜對化合物進(jìn)行了鑒定。樣品中的糖醛酸還原為中性，隨后通過GC-MS進(jìn)行測定[10-11]。

4 血清細(xì)胞因子水平的測定

小鼠給藥2h后從眼眶采集血樣，血清在4℃下以4000 r/min的速度離心分離10min，然后儲(chǔ)存在-80℃，直到測量細(xì)胞因子。根據(jù)制造商的方案，使用ELISA試劑盒測定可溶性細(xì)胞因子的濃度。

5 抗腫瘤活性

取活的癌細(xì)胞（0.2 mL，1×107細(xì)胞 /mL）皮下移植到小鼠右側(cè)腹股溝。接種后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，分別為：生理鹽水對照組、環(huán)磷酰胺（CTX）50 mg/kg組和以 50、100 和 200 mg/kg濃度給藥的三個(gè)三葉青多糖組。每天口服一次生理鹽水和三葉青多糖，連續(xù)10d。每隔一天腹腔注射一次CTX。在接種后4、7和10天內(nèi)測量腫瘤體積。在最后一次給藥后12h，稱量小鼠體重并通過頸椎脫位處死。按照第4所述方法，從眼眶腔采集血樣，以檢測小鼠血清細(xì)胞因子。立即收集腫瘤、脾臟和胸腺并稱重[12-13]。通過以下等式計(jì)算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)：

抑制率（%）=1-（試驗(yàn)組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量）×100

脾 臟 指 數(shù)（mg/g）=脾 臟 重 量 /小 鼠 重 量×1000mg/g

胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量/小鼠重量×1000（mg）/1（g）

6 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

小鼠脾細(xì)胞在RPM中的96孔板（1×106個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)，并與三葉青多糖在0～400μg/mL下孵育48h。隨后，向每個(gè)孔中添加40μLMTS，并將細(xì)胞再孵育2h，記錄490nm處的吸光度[14]。

7 THP-1和RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的測定

THP-1和RAW264.7細(xì)胞，THP-1細(xì)胞用杜爾貝科改良的鷹氏培養(yǎng)基（DMEM）在96孔板（5×104細(xì)胞 /孔）培養(yǎng) 48h。然后，制備四種 0、5、10和 20μg/mL濃度的TAK-242，將LPS和三葉青多糖添加到最終濃度為100μg/mL的三葉青多糖中，并將LPS添加到100ng/mL和1μg/mL中。培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)上清液。將RAW264.7細(xì)胞接種到另一個(gè)96孔板（1×105細(xì)胞/孔）中，重復(fù)與THP-1培養(yǎng)相同的程序。使用商業(yè)ELISA試劑盒測定細(xì)胞因子TNF-α和IP-10的定量。

8 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

使用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 多糖的分離與表征

250 g三葉青葉子中獲得了27.8gWSP。sevag法脫蛋白后，DEAE-Sepharose陰離子交換色譜進(jìn)行分離純化。如圖1A所示，在用0.2 mol/LNaCl溶液洗脫的部分中觀察到一個(gè)相對較強(qiáng)的峰，該峰被收集用于進(jìn)一步純化，而用 0.5 mol/L NaCl溶液洗脫的部分呈現(xiàn)一個(gè)相對較弱的峰，并被丟棄。隨后在Superdex-200柱上對收集的洗脫液進(jìn)行色譜分析，并獲得一個(gè)單峰，如圖1B所示。收集該組分并命名為三葉青多糖以供進(jìn)一步分析。

用HPGPC測定三葉青多糖的均一性。如圖1 C所示，三葉青多糖呈對稱窄峰，保留時(shí)間為8.325min。右旋糖酐的校準(zhǔn)曲線為 lg Mw = 9.9006-0.6184t（R2= 0.9936），（其中 Mw 為分子量，t為保留時(shí)間）。根據(jù)校準(zhǔn)曲線，三葉青多糖的平均分子量約為66.4 kDa，三葉青多糖的總糖和糖醛酸含量分別為84.8%和47.28%。

圖1 多糖的分離和表征

三葉青多糖的FT-IR光譜如圖1D所示。在3398.46 cm-1處觀察到兩種多糖的特征吸收和2945.73cm-1，分別對應(yīng)于碳水化合物的O-H拉伸和芳香結(jié)構(gòu)和甲基的C-H拉伸。1618.34cm-1處的強(qiáng)吸收表明三葉青多糖中存在羧基。峰值為1745.16 cm-1表明存在糖醛酸。[15]

用BCA蛋白檢測試劑盒測定三葉青多糖蛋白含量為4.48%。此外，經(jīng)水解和衍生后，用GC-MS測定三葉青多糖的單糖組成，如圖1E的色譜圖b所示。

GC-MS結(jié)果表明，還原產(chǎn)物（三葉青多糖R）由Glc、Man、Ara、Gal和 Rha。如圖1E 的色譜圖 c所示。

2 三葉青多糖的抗腫瘤活性

如圖2所示，以H22移植瘤小鼠為研究對象，灌胃給予三葉青多糖，評(píng)估其抗腫瘤活性。最后一次給藥后，對照組、CTX組、50mg/kg 三葉青多 糖 組、100mg/kg 三 葉 青 多 糖 組 和 200mg/kg 三葉青多糖組小鼠的體重分別為（36.70g±2.44g）、（34.52g±1.54g）、（33.96g±2.76g）、（34.30g±2.36g）和（34.43g±1.97g）。接種CTX和三葉青多糖后4、7和10天內(nèi)，用CTX和三葉青多糖治療的小鼠的腫瘤體積小于對照組。在不同的三葉青多糖治療組中，觀察到給予大劑量三葉青多糖的小鼠，在所有組中，CTX治療對腫瘤體積的抑制作用最為顯著。結(jié)果表明，三葉青多糖對H22荷瘤小鼠的腫瘤大小和重量均有抑制作用。200mg/kg劑量組對H22腫瘤的抑制率為46.8%，與對照組相比有非常顯著性差異（P<0.01）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SYQP通過與對照組表現(xiàn)出顯著差異來抑制腫瘤生長，并且隨著SYQP給藥劑量的增加，抑制率增加。CTX對腫瘤生長的抑制率為66.9%，比SYQP更有效。

圖2 三葉青多糖對腫瘤生長、器官指數(shù)和脾細(xì)胞增殖的影響。

3 抗脾淋巴細(xì)胞增殖

胸腺和脾臟是動(dòng)物重要的免疫器官，在免疫細(xì)胞的產(chǎn)生和免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。[16]探討三葉青多糖對免疫功能的影響對系統(tǒng)在體、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與對照組相比，CTX組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低（P<0.01），表明CTX抑制了機(jī)體的免疫能力，導(dǎo)致免疫功能減弱。與對照組相比，脾臟和胸腺指數(shù)均有改善，且在劑量為200 mg/kg時(shí)，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，三葉青多糖對H22荷瘤小鼠的免疫器官具有有益作用。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了三葉青多糖對脾細(xì)胞增殖的影響。分離小鼠脾細(xì)胞，用三葉青多糖培養(yǎng)。如圖2 所示，0、50、100、200、400μg /mL的三葉青多糖處理顯著刺激脾細(xì)胞增殖呈劑量依賴性。類似地，這種治療可以促進(jìn)有絲分裂原刺激的脾細(xì)胞增殖，當(dāng)應(yīng)用200μg/mL和400μg/mL的高濃度三葉青多糖時(shí)，獲得了顯著差異。因此，本研究獲得的結(jié)果表明，三葉青多糖可能同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫。[17]

多糖精確的抗腫瘤機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，多糖發(fā)揮抗癌或抗腫瘤活性的一種作用模式可能是激活宿主免疫反應(yīng)。[18]

胃內(nèi)注射三葉青多糖的荷瘤小鼠和用三葉青多糖培養(yǎng)的脾細(xì)胞的增殖均證明了三葉青多糖在體內(nèi)外上調(diào)免疫系統(tǒng)方面的積極作用，這可能與對腫瘤生長的抑制作用有關(guān)。進(jìn)一步研究三葉清對荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平的影響，以了解三葉清的作用機(jī)制。

4 三葉青多糖對荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

探討三葉青多糖對血清細(xì)胞因子水平的抗腫瘤作用，收集血清樣本，用ELISA方法測定細(xì)胞因子。如表1所示，當(dāng)對照組腫瘤重于1g時(shí)，在禁食12h后取出小鼠眼睛并采集血清樣本。盡管正常組與對照組之間幾乎沒有顯著差異，但I(xiàn)NF-γ，與對照組相比，服用100和200 mg/kg 三葉青多糖的荷瘤小鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著升高（P<0.05）。

表1 三葉青多糖對荷H22肝癌小鼠血清細(xì)胞因子的影響（±s）

表1 三葉青多糖對荷H22肝癌小鼠血清細(xì)胞因子的影響（±s）

結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=10），與正常組比較有顯著性差異，*P<0.05；與正常組比較有非常顯著性差異，**P<0.01；與對照組比較有顯著性差異，△P<0.05；與對照組比較有非常顯著性差異，△△P<0.01。

Group Dose（mg/kg） TNF-α（ng/L） IL-6（pg/mL） IFN-γ（ng/L） IL-1β（ng/L）Normal - 377.07±23.10 21.79±4.19 34.88±7.44 15.68±2.01 Control - 332.40±27.59** 16.81±4.81 36.29±8.73 14.66±1.56三葉青多糖 50 355.07±37.21 21.32±4.82 48.75±12.38 12.97±1.56三葉青多糖 100 371.07±24.83△ 23.65±5.59△ 53.64±11.89*△ 14.83±2.56三葉青多糖 200 395.07±20.49△△ 26.11±6.32△△ 71.98±17.99**△△ 17.52±5.23

此外，三葉青多糖處理濃度為10、100和1000μg/mL對H22肝癌細(xì)胞系的體外生長無明顯影響。結(jié)果表明，三葉青多糖的抗腫瘤活性不是通過直接殺死腫瘤細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，但與其免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)[19]。服用三葉清多糖可激活免疫功能，包括巨噬細(xì)胞、T或B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以促進(jìn)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[20]，表明，三葉青多糖中存在高含量的GalA，因此，GalA除了其他成分外，可能在抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)活性方面發(fā)揮重要作用。GalA的生物活性和藥理學(xué)有待進(jìn)一步研究。

5 三葉青多糖與toll樣受體4（TLR4）的結(jié)合激活免疫調(diào)節(jié)因子

如圖3所示，研究發(fā)現(xiàn)，100μg/mL的三葉青多糖和1μg/mL和100 ng/mL的LPS都能刺激THP-1分 泌 TNF-α 和 IP-10，TAK-242阻 斷 TLR4后，TNF-α和IP-10被顯著抑制。在RAW264.7中也觀察到同樣的現(xiàn)象。表示三葉青多糖可以通過MyD88依賴和三重依賴途徑刺激TLR4，這可能與LPS的機(jī)制相同。

圖3 三葉青多糖對TAK-242抑制劑處理的THP-1細(xì)胞因子分泌的影響

討 論

本研究比較了三葉青地上部分的水溶性多糖，發(fā)現(xiàn)在200 mg/kg 三葉青多糖小鼠模型中，對H22腫瘤的抑制率為48.6%。脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾細(xì)胞增殖與三葉青多糖的應(yīng)用成正比，表明多糖激活了免疫功能。添加TLR4抑制劑TAK 242后，三葉青多糖和LPS刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子（包括IP-10和TNF-α）減少，表明三葉青多糖和LPS都通過TLR4刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步的研究表明，服用三葉青多糖可以刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低LPS引起的血清細(xì)胞因子水平，這表明三葉青多糖可能與TLR4競爭，與TLR4相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，結(jié)果表明，三葉青多糖的抗腫瘤活性不是通過腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的，而是通過其多糖的免疫調(diào)節(jié)活性來實(shí)現(xiàn)的。本研究將為開發(fā)三葉青多糖作為腫瘤藥物提供基礎(chǔ)。