涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機(jī)制*

陸星宇，李盼，楊晶，張茜茜，彭建平

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410000

肝衰竭是因多種因素造成的肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重功能障礙，并在臨床表現(xiàn)出現(xiàn)以黃疸、腹水、肝性腦病、肝腎綜合征、感染等癥狀[1]。肝衰竭在中醫(yī)學(xué)中屬于肝瘟范疇，古代醫(yī)家對(duì)肝衰竭的一系列臨床癥候群的病因病機(jī)有一定的見解。古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝衰竭是因?yàn)橥飧幸甙O邪毒，同時(shí)內(nèi)有濕熱、瘀血、痰濁。我院諶寧生教授提出肝衰竭主要的發(fā)生發(fā)展的原因主要在于“毒”與“瘀”，并且提出肝衰竭不僅病情進(jìn)展快，且病情易發(fā)生改變，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，易耗傷營(yíng)血，所以在治療肝衰竭時(shí)，創(chuàng)立了涼血解毒化瘀湯著重于解毒化瘀[2]。經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，我院孫克偉教授在黃疸的辨證基礎(chǔ)上，提出了肝衰竭以“陽(yáng)黃-陰陽(yáng)黃-陰黃”的辨證方法[3]。在臨床中，涼血解毒化瘀湯在治療肝衰竭疾病時(shí)也得到了廣泛的應(yīng)用，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本文根據(jù)中藥復(fù)方及其靶點(diǎn)的特性，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分隊(duì)對(duì)接驗(yàn)證的方法，對(duì)涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機(jī)制進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究提供新的研究思路和方向。

材料與方法

1 涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP），檢索涼血解毒化瘀湯中的藥物赤芍、丹參、虎杖、茵陳、梔子、大黃、白術(shù)的活性成分，因藥物進(jìn)入人體的吸收途徑，通過藥物動(dòng)力學(xué)選取以口服生物利用度（OB） ≥ 30%、類藥性（DL） ≥ 0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選；再通過Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已認(rèn)證的人類基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)的作用靶點(diǎn)規(guī)范化。

2 肝衰竭疾病基因靶點(diǎn)篩選

通 過 Genecards數(shù) 據(jù) 庫(kù) 以“l(fā)iver failure”“l(fā)iver injury”對(duì)疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。并通過Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中Score值選取Score值>中位數(shù)以上的靶點(diǎn)作為肝衰竭的潛在靶點(diǎn)；再通過關(guān)鍵詞在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選，將檢索結(jié)果與Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選后的潛在靶點(diǎn)結(jié)果合并，刪除重復(fù)基因靶點(diǎn)得到肝衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 CytoScape3.8.2構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，使用Cyto-Scape中的Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)degree值及相互作用關(guān)系設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小。

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將所獲取的交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，并將物種設(shè)定為Homo sapiens，其余參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoScape3.8.2，利用內(nèi)置 cytoNCA 插件對(duì) BC、CC、DC、EC、LAC 進(jìn)行兩次打分，根據(jù)得分大于中位值的基因，篩選出PPI的核心基因。

5 GO功能注釋及KEGG通路富集分析

運(yùn)用R語言及Bioconductor平臺(tái)對(duì)基因進(jìn)行編碼，并通過利用Bioco-nductor 平臺(tái)的DOSE，clusterProf-iler，pathview 數(shù)據(jù)包借助R語言繪制GO功能注釋及KEGG通路富集分析圖。

6 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)篩選出的核心靶點(diǎn)及活性成分，利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)，使用Autodock_vina 軟件對(duì)核心靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

結(jié) 果

1 涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP）以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)及ADME篩選，共得到符合條件的活性成分121個(gè)，其中白術(shù)4個(gè)、赤芍14個(gè)、大黃10個(gè)、丹參59個(gè)、虎杖10個(gè)、茵陳13個(gè)、梔子12個(gè)，根據(jù)其活性成分來源對(duì)其重命名，比如澤蘭黃醇素來源于大黃，重命名為DH1；大黃素甲醚葡糖甙同樣來源于大黃，重命名為DH2，以此類推。針對(duì)其多種藥物共有的核心成分，其中β-谷甾醇為赤芍、大黃、虎杖、茵陳、梔子共同成分，命名為A；黃芩素為赤芍、丹參共有，命名為A1；兒茶素為赤芍、虎杖共有，命名為A2；豆甾醇為赤芍、梔子共有，命名為A3；油酸乙酯為赤芍、梔子共有，命名為A4；葡萄糖苷為大黃、虎杖共有，命名為B；大黃酚為大黃、虎杖共有，命名為B1；蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷為大黃、虎杖共有，命名為B2；木犀草素為丹參、虎杖共有，命名為C1；異歐前胡內(nèi)酯為丹參、梔子共有，命名為C2；槲皮素為虎杖、茵陳、梔子共有，命名為D。對(duì)已獲取的成分八點(diǎn)整合篩選后，共得到2277個(gè)作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后可獲得中藥靶點(diǎn)共247個(gè)見表1。

表1 涼血解毒化瘀湯靶點(diǎn)

2 肝衰竭疾病基因靶點(diǎn)篩選

通 過 Genecards數(shù) 據(jù) 庫(kù) 以“l(fā)iver failure”“l(fā)iver injury”篩選獲得靶點(diǎn)11962個(gè)，其最高Relevance score為 73.20，最 低 Relevance sco-re為 0.11，選 取Score值>中位數(shù)2.83以上的靶點(diǎn)；再通過關(guān)鍵詞在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選，將檢索結(jié)果與Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選后的潛在靶點(diǎn)結(jié)果合并，刪除重復(fù)基因靶點(diǎn)得到6025個(gè)肝衰竭基因靶點(diǎn)。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得中藥活性成分及肝衰竭疾病基因靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)201個(gè)。利用 CytoScape3.8.2構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1，使用其內(nèi)置插件Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觯珼egree排名前5的活性成分見表2。

表2 涼血解毒化瘀湯有效組分對(duì)應(yīng)的前10位靶點(diǎn)

圖1 活性成分-疾病靶點(diǎn)

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用CytoScape3.8.2內(nèi)置插件c-ytoNCA第一次 打 分 得 BC（b-etweenness）≥ 58.73218043，CC（closeness） ≥ 0.515625，DC（degree） ≥ 32，EC（eigenvector） ≥ 0.045051977，LAC（local average connectivity-based method） ≥ 20.45714286；第 二次 打 分 得 BC≥ 15.29512971，CC≥ 0.781609195，DC≥ 49，EC≥ 0.119799711，LAC≥ 40.28；根據(jù)兩次得分>中位值篩選，共獲得網(wǎng)絡(luò)核心基因共30個(gè)見圖2。

圖2 PPI核心網(wǎng)絡(luò)

5 GO功能注釋

運(yùn)用R軟件及Bioconductor平臺(tái)將涼血解毒化瘀湯-肝衰竭交互靶基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析，按照P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，根據(jù)P值從小到大分別選取分子功能MF、生物學(xué)過程BP、細(xì)胞成分CC前10條通路繪制GO通路圖見圖3。由圖可知涼血解毒化瘀湯和肝衰竭的共同靶點(diǎn)主要集中分布于膜筏、蛋白激酶復(fù)合物、質(zhì)膜筏、突觸后膜、突觸膜、細(xì)胞器外模、線粒體外模等細(xì)胞組分中，通過RNA聚合酶II-特異因子結(jié)合、脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄、核受體活性配體-激活、轉(zhuǎn)錄因子活性蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體等方式參與對(duì)異生素、脂多糖、細(xì)菌源性分子及氧水平的反應(yīng)等生物進(jìn)程，從而發(fā)揮涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用。

圖3 GO分子功能注釋

6 KEGG富集分析

運(yùn)用R軟件及Bioconductor平臺(tái)將涼血解毒化瘀湯-肝衰竭交互靶基因進(jìn)行 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析，設(shè)置P< 0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，根據(jù)P值，從小到大選取前20條通路繪制KEGG信號(hào)通路圖見圖4。

圖4 KEGG富集分析

由圖可知涼血解毒化瘀湯核心靶點(diǎn)主要富集于AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-Akt、FoxO、C-型凝集素受體等多條通路，表明涼血解毒化瘀湯主要通過調(diào)控以上多條通路發(fā)揮治療肝衰竭的作用。

7 分子對(duì)接驗(yàn)證

為了驗(yàn)證涼血解毒化瘀湯與相關(guān)靶標(biāo)的關(guān)系及其作用機(jī)制，本研究選擇了相關(guān)度高的10個(gè)靶點(diǎn)分別和涼血解毒化瘀湯中的3個(gè)有效組分STAT3、CASP3、IL6分別進(jìn)行進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)合自由可顯示分子間的結(jié)合能力以及相互作用能力見表3。本位選取槲皮素和丹參酮分別與STAT3、CASP3、IL6做分子對(duì)接結(jié)果可視化見圖5。

表3 分子對(duì)接自由功能

圖5 分子對(duì)接可視化

討 論

本研究通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接驗(yàn)證探討涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機(jī)制。通過研究結(jié)果可知槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹參酮等是治療肝衰竭的核心成分。TP53、IL6、TNF、STAT3等靶點(diǎn)是肝衰竭疾病治療的重要靶點(diǎn)?；贕O和KEGG富集分析可知，其中AGERAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、IL-17信號(hào)通路、HIF-1、TNF信號(hào)通路及脂質(zhì)代謝與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。

現(xiàn)代醫(yī)家諶寧生教授提出肝衰竭病機(jī)關(guān)鍵在于“毒”“瘀”，在治療時(shí)提出重在解毒，貴在化瘀的觀點(diǎn)。由表2可知，赤芍主要核心成分為β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素等，方中赤芍入肝經(jīng)，清熱涼血，活血化瘀，臨床上在治療肝衰竭時(shí)也多重用赤芍，阻斷了肝細(xì)胞進(jìn)一步受損[4]。茵陳的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇等，方中茵陳清熱利濕，為退黃之要藥?；⒄鹊闹饕诵某煞质情纹に?、β-谷甾醇、木犀草素等，方中虎杖清熱利濕?；⒄扰c茵陳配用有明顯的抗菌、抗病毒及保肝利膽作用[5]。丹參的主要核心成分為木犀草素、丹參酮、鼠尾草酚酮等，方中丹參清熱利血，使血脈通暢，瘀散結(jié)消。丹參可改善微循環(huán)增強(qiáng)肝臟血流量促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)與再生[5]。梔子的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇，方中梔子清熱利濕，涼血解毒。方中同時(shí)運(yùn)用大黃瀉火通便，利肝膽濕熱，清除腸道內(nèi)毒素；白術(shù)益氣健脾。全方以涼血化瘀、清熱解毒為宗旨，注重從肝衰竭“毒”“瘀”角度入手，從根本上治療肝衰竭。

槲皮素可以通過抑制AGE-RAGE信號(hào)途徑進(jìn)而抑制 NF-κB、STAT1、cAMP、MAPK 等多條信號(hào)通路調(diào)控抑制iNOS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及NO釋放，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用從而抑制細(xì)胞凋亡及組織損傷[6]；其次槲皮素還可通過抑制HMGB1減少線粒體途徑中細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和凋亡反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)L02細(xì)胞免受d-半乳糖胺誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[7]；槲皮素及β-谷甾醇具還可通過減輕CCL4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)酶NQO1緩解CCL4誘導(dǎo)的肝損傷[8]。β-谷甾醇不僅具有抗氧化，抗炎的作用，同時(shí)可以參與免疫調(diào)節(jié)，可通過誘導(dǎo)HepG2/ SMMC-7721細(xì)胞凋亡，抑制D-半乳糖胺及脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷[9]。木犀草素可通過抑制TXNIP-NLRP3炎癥小體、TNF-α、IL-10和IL-6的產(chǎn)生改善脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷[10]；還可通過下調(diào)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的硝基酪氨酸形成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少肝損傷中存在抗氧化、抗炎和抗雌激素受體應(yīng)激特性[11]。豆甾醇可通過打開線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔、激活線粒體ATP酶（mATPase）活性和釋放細(xì)胞色素c誘導(dǎo)線粒體依賴性凋亡[12]。山奈酚調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-Grp78-CHOP信號(hào)通路，抑制p-JNK和Endo G蛋白來抑制乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡以達(dá)到肝細(xì)胞的保護(hù)作用[13-14]；還可以通過抑制 NF-κB 途徑，減少炎癥因子的產(chǎn)生從而達(dá)到減輕肝細(xì)胞凋亡[15]。

在核心PPI中，我們可知 TP53、IL6、TNF、STAT3等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。STAT3經(jīng)過IL-6的刺激磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，參與基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖與分化，而Th-17細(xì)胞表達(dá)為IL-17因子造成肝衰竭[16]。TNF可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6、IL-8等炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的炎性反應(yīng)，從而促使肝衰竭的發(fā)生[17]，TNF可以通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)與FAS死亡受體結(jié)合，可以激活凋亡起始物caspase-8，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；還可產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥，誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS迅速升高等多種途徑誘導(dǎo)肝臟炎癥及損傷[18-20]。

AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用可造成一系列的炎癥反應(yīng)從而引起細(xì)胞凋亡及組織損傷，是肝衰竭形成的重要機(jī)制之一。RAGE是目前研究最多的AGE受體之一，其在許多細(xì)胞表面均有表達(dá)[21]。AGE通過與RAGE的結(jié)合從而激活NF-κB[22]。NF-κB具有顯著的促進(jìn)炎癥的特性，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要通路之一，其可誘導(dǎo)大量炎癥因子如TNF-α、iNOS、IL-1的產(chǎn)生從而加重肝細(xì)胞凋亡，而炎癥因子的增加可進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的產(chǎn)生，從而形成惡性循環(huán)[23-24]；乙二醛酶的活性降低可以導(dǎo)致偶聯(lián)蛋白-2減少?gòu)亩鹁€粒體功能障礙相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)肝臟蛋白質(zhì)糖基化，加重了炎癥誘導(dǎo)的肝損傷，通過rRAGE阻斷AGE/RAGE結(jié)合能夠完全消除與炎癥損傷增加相關(guān)的線粒體功能障礙[25]，AGE和RAGE的可通過多元醇途徑、蛋白激酶 C等途徑結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而激活絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號(hào)，產(chǎn)生炎癥因子，引起細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，涼血解毒化瘀湯可能通過參與調(diào)節(jié)AGE-RAGE的信號(hào)通路治療肝衰竭[26]。

小 結(jié)

經(jīng)過本研究的分析可知，涼血解毒化瘀湯可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療肝衰竭，根據(jù)現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹參酮等可能是涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的主要成分，猜測(cè)其主要可能通過多通路調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及改善線粒體質(zhì)量來抑制肝細(xì)胞凋亡。同時(shí)，通過運(yùn)用分子對(duì)接探討涼血解毒化瘀湯核心成分與肝衰竭疾病的核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力，可以為涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭提供了一定的理論依據(jù)。

但在相關(guān)研究的過程中，發(fā)現(xiàn)基因TP53在肝衰竭疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確，在接下來的臨床及科研研究中，可以繼續(xù)探討并驗(yàn)證基因TP53在肝衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，是否可以通過調(diào)控基因TP53從而調(diào)控其相關(guān)的生物進(jìn)程達(dá)到治療肝衰竭的目的。

通過以上所述，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究可知，涼血解毒化瘀湯是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路達(dá)到治療肝衰竭的效果。本次研究?jī)H為涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的機(jī)制進(jìn)一步研究提供了新思路和新方法，為涼血解毒化瘀湯的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但本研究未加入藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果具有一定的局限性。