參竹心康方治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制*

趙夢雪，喻正科，趙啟，李珊珊，陳靜

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410006

2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 湖南長沙 410006

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各種原因?qū)е碌男呐K收縮或舒張功能異常，無法滿足身體的代謝需求，由此產(chǎn)生的一系列癥狀和體征的臨床綜合征[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國心血管疾病現(xiàn)患人數(shù)高達(dá)3.3億，其中心力衰竭890萬例[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，65歲以上人群心衰發(fā)病率高，死亡率和再住院率居高不下[3-4]，預(yù)計未來20年內(nèi)，心衰的患病率將增加25%[5]，全球負(fù)擔(dān)將急劇增加。目前西醫(yī)治療心衰主要以強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管、拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌激活及改善心室重構(gòu)為主，主要針對心臟本身癥狀，不能解決心衰常見的伴發(fā)癥狀，大量臨床及實驗證明中醫(yī)藥可以通過多方面、多靶點的相互作用對慢性心力衰竭進(jìn)行調(diào)控和改善，由此體現(xiàn)出其顯著優(yōu)勢和廣闊前景[6]。

參竹心康方是湖南省名中醫(yī)喻正科教授的臨床經(jīng)驗方，由黨參、麥冬、黃芪、五味子、丹參、玉竹、三七、黃精、紅花、澤蘭、姜黃、葶藶子12味中藥組成，主要針對慢性心力衰竭氣陰兩虛，瘀血內(nèi)阻這一主要病機(jī)，既往多項研究均證實參竹心康方對慢性心力衰竭療效顯著，能夠降低心力衰竭患者胰島素抵抗，提高胰島素敏感性；改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；減輕心肌纖維化、改善心室重構(gòu)等[7-13]。在不斷完善的計算機(jī)技術(shù)的支持下，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)蓬勃發(fā)展，日益成熟，揭示出藥物成分在疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮的作用，其構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與中醫(yī)學(xué)理論體系中整體觀念這一基本特點相契合[14]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從物質(zhì)基礎(chǔ)和分子水平探索參竹心康方治療CHF的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

1 參竹心康方活性成分及相關(guān)靶點篩選

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），尋找中藥化學(xué)組成成分，以O(shè)B≥30%且類藥性DL≥0.18兩個ADME屬性值作為靶點篩選標(biāo)準(zhǔn)。將所獲蛋白質(zhì)靶點在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中完成基因名稱的轉(zhuǎn)化。檢索 ETCM 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）篩選補充TCMSP中未收錄的中藥—麥冬的化學(xué)成分，在化源網(wǎng)（https：//www.chemsrc.com/）中獲取化學(xué)成分 CAS號，利用 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢麥冬化學(xué)成分的2D結(jié)構(gòu)及SMILES 結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫（http：// www.swissadme.ch/）后，分析其胃腸道吸收利用度（gatrointestinal absorption，GA）及 DL，篩選條件：GA 值為“High”、DL5項（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、 Muegge）中“Yes”≥ 2 項。將篩選出的活性成分的2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），選擇“homo sapiens”為物種信息，預(yù)測作用靶點，篩選條件：probability>0，完成麥冬活性成分作用靶點的篩選。

2 構(gòu)建參竹心康方“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

將參竹心康方活性成分及靶點文件分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建參竹心康方“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer功能做進(jìn)一步分析，獲得具體特征數(shù)據(jù)及關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

3 慢性心力衰竭相關(guān)靶點篩選

以“chronic heart failure”為檢索關(guān)鍵詞，在 Dis-GeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、DrugBank數(shù) 據(jù) 庫（https：//go.drugbank.com/）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中尋找CHF的潛在靶點，根據(jù)經(jīng)驗以“Score”值為GeneCard 數(shù)據(jù)庫篩選依據(jù)，設(shè)置Score值大于中位數(shù)，合并各疾病數(shù)據(jù)庫靶點，刪除重復(fù)值得到CHF靶點。

4 參竹心康方治療慢性心衰共同靶點的篩選

利用在線韋恩分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制參竹心康方活性成分與CHF相關(guān)靶點韋恩圖并獲取交集靶點。

5 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將參竹心康方與CHF交集靶點導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇人類物種，設(shè)置置信度>0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以TSV格式保存，在Cytoscape3.7.1中進(jìn)行可視化處理，以節(jié)點連接度（Degree）為指標(biāo)，篩選Degree排名前6的靶點為核心靶點[15]。

6 通路富集分析

Metascape 平 臺（http：//metascape.org/gp/index.html）數(shù)據(jù)全面可靠，是目前最權(quán)威的數(shù)據(jù)平臺之一。將參竹心康方與CHF共同靶點導(dǎo)入Metascape平臺，分別進(jìn)行信號通路富集（KEGG）分析和基因功能分類（GO），設(shè)置P<0.01，應(yīng)用微生信平臺（http：//www.Bioinformatics.com.cn）將結(jié)果進(jìn)行KEGG 通路富集分析氣泡圖和GO生物功能分析柱狀圖的繪制。

結(jié) 果

1 參竹心康方活性成分及相應(yīng)靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到158個有效成分，其中黃芪17個，玉竹5個，丹參54個，三七7個，黃精9個，紅花15個，澤蘭2個，姜黃3個，葶藶子9個，麥冬12個，五味子8個，黨參17個。

檢索出靶點1688個，其中黃芪213個，玉竹18個，丹參136個，三七184個，黃精85個，紅花205個，澤蘭44個，姜黃32個，葶藶子188個，麥冬457個，五味子19個，黨參107個，去除重復(fù)靶點后，共得到618個藥物靶點。

2 參竹心康方“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用 Cytoscape 3.7.1繪制出參竹心康方活性成分及靶點的互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行Network Analyzer分析后，共獲得776個節(jié)點（包含618個靶點和158個活性成分）與4016條關(guān)系（圖1）。根據(jù)Degree值，由高到低將參竹心康方的部分活性化合物進(jìn)行排序（表1）。這些化合物分別為：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麥冬黃烷酮B、常春藤皂苷元、黃芩苷、異鼠李素等。

表1 參竹心康方核心活性成分信息

圖1 “活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

3 慢性心衰疾病靶點

檢索 DisGeNET、DrugBank、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到慢性心衰靶點個數(shù)分別為224、13、577、1325，篩選匯總以上數(shù)據(jù)庫靶點，去除重復(fù)項，獲得1913個疾病靶點。韋恩圖結(jié)果顯示，藥物與疾病交集靶點為206個（圖2）

圖2 藥物靶點和疾病靶點分布圖

4 靶點蛋白的交互作用網(wǎng)絡(luò)

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）可知，該網(wǎng)絡(luò)由206個節(jié)點及4684條相互作用的邊組成。選取節(jié)點度值為評價指標(biāo)，數(shù)值越大表明其在此網(wǎng)絡(luò)中越重要，在生物學(xué)功能中發(fā)揮的作用也更加突出；從顏色來看，節(jié)點度值由大到小，其節(jié)點顏色由藍(lán)綠黃橙依次漸變。排名前六的靶點為 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B，這些就可能是參竹心康方治療CHF的關(guān)鍵靶點。

圖3 參竹心康方對慢性心衰作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（Degree>20）

5 GO生物功能和 KEGG 通路富集分析

將參竹心康方與CHF共同靶點導(dǎo)入Metascape平臺，進(jìn)行 GO 生物功能分析和 KEGG 通路富集分析，獲得 GO 生物功能條目2791 條，其中生物過程有2428條，主要涉及激酶活性的調(diào)節(jié)、對無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、凋亡信號通路的調(diào)控等；細(xì)胞組分共139 條，主要涉及膜筏、囊泡腔、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等；分子功能224條，主要涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、激酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集分析共獲得204 個信號通路，主要涉及癌癥的途徑、AGERAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路、Th17細(xì)胞分化、糖尿病性心肌病、鈣信號通路、cAMP信號通路、腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)、cGMP-PKG信號通路等。見圖4-5及表2。

表2 復(fù)方作用靶點KEGG分析

圖4 參竹心康方治療慢性心衰活性成分-疾病共同靶點 GO 分析

討 論

心衰病名最早出現(xiàn)在宋·趙估所編《圣濟(jì)總錄·心臟門》，根據(jù)疾病特點，多將本病歸屬于中醫(yī)學(xué)“脫證”“心悸”“喘息”“水腫”“痰飲”“心痹”等范疇，總以本虛標(biāo)實，本虛乃氣虛陽虛，突出心腎；標(biāo)實為痰、水、瘀，三者同為病因又作為病理產(chǎn)物互相影響[16]。參竹心康方針對慢性心力衰竭常見之氣陰兩虛，瘀血內(nèi)阻的病機(jī)組方，以黨參、麥冬為君，相輔相成，益氣養(yǎng)陰。黃芪、五味子補益心肺，配伍黨參助心肺鼓動血脈；玉竹與麥冬合用，更滋心陰，丹參、三七活血化瘀，黃精補氣養(yǎng)陰，以上六味同為臣藥。紅花、澤蘭佐助臣藥丹參、三七活血通脈，葶藶子瀉肺平喘利水，以上三味共為佐藥。諸藥合用則中氣鼓舞，心肺氣血充沛，氣行則瘀血化，全方共奏氣血同治、補瀉兼施之功[17]。

本研究通過分析“復(fù)方-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，選取Degree值作為標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測出參竹心康方治療CHF的主要成分為：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麥冬黃烷酮B、常春藤皂苷元、黃芩苷、異鼠李素等。槲皮素作為黃酮類化合物在自然界分布廣泛，研究發(fā)現(xiàn)其在多個系統(tǒng)的疾病中都發(fā)揮了藥用價值，在心血管方面，作用包括抗心肌纖維化、改善心功能、保護(hù)血管內(nèi)皮、減輕心肌炎性損傷、糾正心室重構(gòu)以及抗血小板聚集等[18]。山奈酚對心臟成纖維細(xì)胞的增殖與活化具有明顯抑制作用，可以調(diào)節(jié)ASK1/MAPK信號通路的傳導(dǎo)預(yù)防心臟肥大，機(jī)制涉及對ROS水平、細(xì)胞色素C釋放的調(diào)節(jié)以及對線粒體膜電位的維持等[19-20]。木犀草素具有顯著的心血管疾病相關(guān)益處，能夠降低心肌缺血再灌注造成的損傷，并且能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對心力衰竭的保護(hù)作用。阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心衰實驗表明[21]，長期的木犀草素治療能夠部分逆轉(zhuǎn)心室重塑改善心功能，其作用機(jī)制與抑制TNF-α誘導(dǎo)的ROS的生成、降低NOX4、p22phoxex的表達(dá)、增強(qiáng)心肌肌漿網(wǎng) Ca2+ -ATP 酶（SERCA2a）的轉(zhuǎn)錄活性等密切相關(guān)[22-23]。黃芩苷可抑制心肌纖維化，抑制MMP2 和 MMP9 的表達(dá)和活性，以及心臟組織中的凋亡。在心肌缺氧時，可產(chǎn)生ROS，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，使心肌細(xì)胞存活，通過下調(diào)Ca（2+）/CaMKII的磷酸化和SERCA2和RYR2的上調(diào)等起到減輕心肌重塑并改善心功能的作用[24]。異鼠李素具有多種生物活性，在心血管方面，具有抑制血管平滑肌、心肌細(xì)胞增生肥大、抗炎、抗栓等多種作用[25]。

圖5 參竹心康方治療慢性心衰活性成分-疾病共同靶點KEGG分析

本研究所得靶點按照度值排名，較為重要的有 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B、EGFR、CASP3、JUN、CTNNB1。AKT可以調(diào)節(jié)心肌生長、心肌血管生成、葡萄糖代謝和心肌細(xì)胞死亡。 AKT1作為AKT的亞型，廣泛存在于機(jī)體各組織中。研究表明，AKT1通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（eNOS）促進(jìn)細(xì)胞存活；通過促進(jìn)Ser9磷酸化使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）蛋白失活防止細(xì)胞凋亡；通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的水平實現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的調(diào)控；還能抑制RPS6KB1信號傳導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞自噬等，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[26，27]。VEGFA是血管通透性和血管生成的主要調(diào)節(jié)劑，還可以激活參與心肌收縮和新陳代謝的基因的表達(dá)。研究表明，VEGFA在心臟疾病的病理過程中作用顯著，通過與心肌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）一起促進(jìn)心肌梗死內(nèi)的心臟干細(xì)胞動員和心肌修復(fù)；在心衰中，通過功能性上調(diào)誘導(dǎo)血管生成，建立側(cè)支循環(huán)保護(hù)心肌；通過促進(jìn)NO、PGI2的生成，共同發(fā)揮參與血管內(nèi)皮修復(fù)、保護(hù)內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用，延緩心衰進(jìn)展；通過其在血栓調(diào)控中的雙重作用，改變凝血機(jī)制，使凝血與抗凝機(jī)制在心衰病程中趨于平衡[28]。IL-6是炎癥因子之一。研究發(fā)現(xiàn)，長期持續(xù)的IL-6信號會使心肌收縮力下降，左室增大，肥大基因發(fā)生逆轉(zhuǎn)，誘發(fā)心衰，此過程為IL-6結(jié)合IL-6受體后，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體復(fù)合物gp130，該復(fù)合物與IL-6受體結(jié)合產(chǎn)生的下游信號，通過RAS-MAPK、JAK-STAT或PI3K通路，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[29]。TNF是炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，分為TNF-α、 TNF-β 兩種，TNF-α 是最有效的促炎細(xì)胞因子之一，被選作細(xì)胞因子靶向入路的首要靶點。研究表明TNF-α在心臟疾病中體現(xiàn)出復(fù)雜性的特征，更多地發(fā)揮對心臟的保護(hù)作用，機(jī)制可能與缺氧狀態(tài)下TNFR2的高表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖相關(guān)[30]。TP53作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)許多負(fù)責(zé)DNA修復(fù)、細(xì)胞代謝與遷移、血管的生成與衰老和凋亡基因的表達(dá)。除抑制腫瘤生成外，還可以作為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞的開關(guān)，減少心臟病發(fā)作后形成的瘢痕，進(jìn)而改善心功能[31]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，與參竹心康方治療CHF密切相關(guān)的通路主要包括：PI3K-Akt 信號通路、JAK-STAT信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等。P13K-Akt通路對于調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡、代謝、減少氧化應(yīng)激及血管再生等具有重要作用，研究表明，PI3K 的啟動可以募集Akt并促進(jìn)其磷酸化，活化后的Akt通過多種途徑增強(qiáng)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡因子、調(diào)節(jié)鈣離子濃度，對心肌細(xì)胞的凋亡起到抑制作用[32-33]。JAK-STAT 信號通路在心臟病理生理學(xué)中起核心作用。JAK-STAT 信號傳導(dǎo)與壓力過載誘導(dǎo)的心臟肥厚和重塑、缺血預(yù)處理和缺血/再灌注誘導(dǎo)的心臟功能障礙相關(guān)。STAT3作為STAT的家族組分之一是JAK的重要底物，具有抗炎、抗凋亡的作用[34]，其發(fā)揮作用的機(jī)制為心肌缺血期間STAT3的磷酸化增加，促使凋亡相關(guān)基因bax及caspases的表達(dá)增加[35]。眾多研究表明，在心力衰竭這一疾病進(jìn)程中會出現(xiàn)鈣信號通路的異常，隨著舒張期肌漿網(wǎng)功能失常，鈣離子會大量流漏，鈣離子穩(wěn)態(tài)失常，導(dǎo)致心肌收縮力降低，引發(fā)心臟重構(gòu)。cAMP通過β-AR信號傳遞產(chǎn)生，并通過AMP水解酶磷酸二酯酶（PDE）抑制，cAMP的增加導(dǎo)致cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）和Epac的激活，研究表明，這些蛋白質(zhì)可以激活鈣處理蛋白、RyRs和SERCA2a，由此達(dá)到維持心肌鈣穩(wěn)態(tài)及心肌收縮舒張功能、抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕心肌損傷的作用。[36]。cGMP-PKG信號通路對心臟收縮與舒張功能具有調(diào)控作用，進(jìn)而對心室重構(gòu)產(chǎn)生影響，這一作用通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度來實現(xiàn)[37]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對參竹心康方治療慢性心力衰竭過程中的機(jī)制進(jìn)行探索。通過對活性成分、作用靶點及信號通路的研究，推測出參竹心康方可能是通過復(fù)方中槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩苷、異鼠李素等關(guān)鍵活性成分，結(jié)合AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53等 核 心 靶 點，通 過 調(diào) 控PI3K-Akt、JAK-STAT、鈣、cAMP、cGMP-PKG 等信號通路來發(fā)揮對慢性心力衰竭的治療作用。這體現(xiàn)出參竹心康方多通路、多靶點聯(lián)合作用的特點，為今后深入研究其藥理作用提供方向和參考，預(yù)測結(jié)果有待細(xì)胞及動物實驗等進(jìn)一步驗證。