自噬相關(guān)蛋白在牙周病發(fā)生發(fā)展中作用的研究

郝 鴻

（華中科技大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430074）

牙周病是指由牙菌斑的刺激產(chǎn)物引起的牙周組織炎性疾病。牙周病會(huì)破壞牙支持組織，會(huì)導(dǎo)致牙齦紅腫、疼痛、出血，進(jìn)一步發(fā)展后可導(dǎo)致牙槽骨的吸收，繼而導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、移位、脫落。正常情況下，自噬是一種常見的細(xì)胞現(xiàn)象，既能抑制也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這兩種反應(yīng)在生物體內(nèi)均廣泛存在。在營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬反應(yīng)是一個(gè)細(xì)胞的促活反應(yīng)機(jī)制，但是過度的自噬反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]?？谇恍l(wèi)生不佳時(shí)，大量的細(xì)菌會(huì)影響牙周生態(tài)系統(tǒng)；一旦細(xì)菌數(shù)量過多，牙齦上皮細(xì)胞會(huì)處于相對(duì)營養(yǎng)匱乏的狀態(tài)，這極易導(dǎo)致其死亡。有研究[2-3]表明，自噬相關(guān)蛋白與牙周病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文針對(duì)自噬相關(guān)蛋白在牙周病發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行初步探討?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 研究資料及方法

1.1 研究資料

選取我院近3 年（2019 年1 月至2022 年1 月期間）收治的牙周病患者86 例作為觀察組，選擇同期在我院進(jìn)行同牙位正畸治療但牙周健康的患者30 例作為對(duì)照組?；仡櫡治鰞山M的臨床資料。觀察組：男47 例，女39 例；年齡20 ～55 歲，平均（37.54±2.16）歲。對(duì)照組：男17 例，女13 例；年齡21 ～53 歲,平均(37.23±2.36)歲。兩組的基本資料相比均衡性良好(P＞0.05) ，有可比性。

1.2 方法

兩組患者均分別采集牙周袋標(biāo)本：采集菌斑，選擇吸潮紙，蘸取齦溝液，放入牙周袋15 s 后取出，剪下尖端放入離心管。將采集的樣本放入滅菌PBS 中保存（-20℃）。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法：離心，棄上清，加入1 mL 膠原酶；放入孵育箱45 min(每5 min 振蕩1 次)；離心，棄上清，用10% 胎牛血清培養(yǎng)液沖洗，重復(fù)3次。吸出組織塊，種入培養(yǎng)瓶（含有2 mL 20% 胎牛血清培養(yǎng)液）中。加入500 μL 20% 胎牛血清培養(yǎng)液，待細(xì)胞從組織塊中游出，然后再添加培養(yǎng)液。置于顯微鏡下觀察。使用1 mg/L 脂多糖刺激上述細(xì)胞，引起致炎反應(yīng)，作用時(shí)間為48 h。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

兩組均應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 B（LC3B）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 Av1（LC3Av1）的表達(dá)情況。方法是：（1）蛋白樣本的制備。以細(xì)胞胰酶對(duì)樣本進(jìn)行消化離心，棄上清，加入NP-40 裂解液。經(jīng)超聲充分裂解后，以15000 r/min的速度離心5 min，取上清液。以BCA 法測(cè)定蛋白濃度。（2）蛋白質(zhì)印跡：經(jīng)15% SDS-PAGE 電泳使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以5% 脫脂奶粉封閉，用PBS-T 漂洗3 次。加入1:5000 稀釋兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1抗體，4℃孵育過夜后，用PBS-T 漂洗3 次。再分別加入帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的稀釋抗兔二抗、抗鼠二抗，孵育60 min，用PBS-T 漂洗3 次。最后鏡下觀察并攝片。（3）細(xì)胞免疫熒光染色。細(xì)胞用4%甲醛固定后，行PBS 漂洗，繼而用3% 過氧化氫甲醇乳液孵育。封閉滲透30 ～45 min，用PBS 清洗3 次，一抗為1:5000稀釋兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1 抗體，4℃孵育過夜；行PBS 清洗，加入1:2000 稀釋抗兔二抗，置入SP-9001C 液中室溫避光孵育60 min ；行PBS 清洗，以DAPI 工作液(1 mg/L) 進(jìn)行細(xì)胞核染色，保持15 min后行PBS 清洗，封片劑封固。以熒光顯微鏡觀察取像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS 23.0 版本）分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 致炎反應(yīng)作用后兩組LC3B 的表達(dá)情況

本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色處理后，對(duì)照組、觀察組（0 h）樣品組織中均可見LC3B 的表達(dá)。脂多糖刺激6 h、12 h 后，對(duì)照組的LC3B 陽性表達(dá)率較低，而觀察組的LC3B 陽性表達(dá)率較高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，觀察組的LC3B 陽性表達(dá)率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，觀察組的LC3B陽性表達(dá)率增加，24 h、48 h 后有所下降。觀察組各時(shí)間段的LC3B 陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 致炎反應(yīng)作用后兩組LC3B 的表達(dá)情況[例(%)]

2.2 致炎反應(yīng)作用后兩組LC3Av1 的表達(dá)情況

本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色處理后，對(duì)照組、觀察組（0 h）樣品組織中均可見LC3Av1 的表達(dá)。脂多糖刺激6 h、12 h 后，對(duì)照組的LC3Av1陽性表達(dá)率較低，而觀察組的LC3Av1 陽性表達(dá)率較高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，觀察組的LC3Av1 陽性表達(dá)率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，觀察組的LC3Av1 陽性表達(dá)率增加，24 h、48 h 后有所下降。觀察組各時(shí)間段的LC3Av1 陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 致炎反應(yīng)作用后兩組LC3Av1 的表達(dá)情況[例(%)]

3 討論

牙周病是一種慢性細(xì)菌感染性疾病。該疾病的早期癥狀不易引起重視，等到有自覺癥狀時(shí)，它已進(jìn)展至較為嚴(yán)重的程度，主要癥狀表現(xiàn)為牙齦紅腫、肥大或萎縮，嚴(yán)重者可致牙齒松動(dòng)、咬合無力、持續(xù)鈍痛等。如不及時(shí)治療，可造成牙齒移位、脫落，嚴(yán)重影響健康[4-5]。目前臨床上公認(rèn)菌斑是牙周病的致病因子。牙周病患者在早期往往沒有明顯的自覺癥狀，隨著病情的進(jìn)展，很多患者會(huì)出現(xiàn)刷牙時(shí)牙齦出血的情況，有些患者還會(huì)出現(xiàn)牙齦腫脹不適、口腔異味等癥狀。如果病情不能得到有效控制，牙周病的癥狀會(huì)表現(xiàn)得越來越明顯，繼而出現(xiàn)牙齦腫痛、牙齒松動(dòng)、牙齦“萎縮”、牙齒移位、咀嚼無力等癥狀，到疾病的晚期牙齒可能會(huì)自行脫落[6]。在免疫反應(yīng)中，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞溶質(zhì)的成分會(huì)被降解，細(xì)胞胞質(zhì)中會(huì)形成具有雙層膜杯狀分隔膜的自噬前體，溶酶體分隔膜不斷延伸，并逐步包裹細(xì)胞垃圾，形成密閉的自噬體囊泡。它可降解其包裹的細(xì)胞成分，并循環(huán)再利用降解產(chǎn)物。同時(shí)細(xì)胞自噬能為細(xì)胞部件提供燃料，供應(yīng)能量，或提供材料來更新細(xì)胞部件。目前，臨床上已鑒定出許多自噬相關(guān)基因，且證實(shí)了細(xì)胞自噬在進(jìn)化上具有高度保守性，其自噬機(jī)制和生理功能也得到了深入的研究。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)自噬的作用很多，包括改善免疫、代謝、內(nèi)分泌、抗炎、提高線粒體效能、對(duì)抗感染、預(yù)防阿爾茲海默癥等退行性疾病、抑制腫瘤細(xì)胞等有益作用。LC3 是自噬研究中常用的檢測(cè)指標(biāo)之一。當(dāng)自噬形成時(shí)，LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3- Ⅱ，繼而參與膜的延伸。在自噬過程中，LC3- Ⅰ在ATG7 和ATG3 泛素樣反應(yīng)下參與活動(dòng)，并與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，繼而生成脂質(zhì)化形式的LC3-Ⅱ。LC3- Ⅱ由于磷脂酰乙醇胺的修飾，導(dǎo)致電荷變化，使得其遷移更快，所以在SDS-PAGE 中顯得分子量比LC3- Ⅰ小。但由于ATG4B 僅存在于自噬早期階段的雙層膜上，且LC3在自噬過程中不斷被切割和降解，所以很難單純根據(jù)此指標(biāo)判斷機(jī)體自噬是否被激活或抑制[7-8]。LC3- Ⅱ增多時(shí)，自噬活性增強(qiáng)，其被廣泛作為細(xì)胞自噬標(biāo)志物。LC3- Ⅰ/ Ⅱ的形成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程[9]。牙周病患者外周血腫中自噬相關(guān)蛋白LC3B、LC3Av1 的表達(dá)水平明顯增高，可見自噬在其疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[10]。LC3B 作為L(zhǎng)C3 家族蛋白，是LC3 的一種，其同樣可以用作自噬的分子標(biāo)志。通過使用抗LC3B 抗體檢測(cè)LC3B，可以大大增加相關(guān)實(shí)驗(yàn)的成功率。我們通過使用1 mg/L 脂多糖刺激樣品細(xì)胞，在誘導(dǎo)或抑制后，觀察自噬過程，并檢測(cè)LC3Av1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是炎性細(xì)胞還是正常細(xì)胞都保持一定的自噬活性。而在牙周病患者的外周血腫中自噬相關(guān)蛋白LC3B、LC3Av1 的表達(dá)水平明顯增高。牙周病的病因包括局部因素和全身因素，兩者之間有密切的關(guān)系。例如牙結(jié)石的致病因素主要是表面形成的未鈣化菌斑的刺激及牙結(jié)石本身堅(jiān)硬粗糙，對(duì)牙齦造成機(jī)械刺激；牙面色素有助于提供菌斑積聚和刺激牙齦的粗糙表面，繼而造成牙周組織炎癥，臨床研究多認(rèn)為該因素可作為評(píng)估口腔衛(wèi)生情況和相關(guān)微生物增殖情況的指標(biāo)。食物被咬合壓力楔入相鄰兩牙的間隙內(nèi)，是局部牙周組織被破壞最常見的原因之一。嵌塞的機(jī)械作用及細(xì)菌的定植，除可引起牙齦組織的炎癥及出血外，還可以引起牙齦退縮、牙槽骨吸收和口臭等。咬合關(guān)系不正?；蛞Ш狭α坎粎f(xié)調(diào)可引起牙周支持組織損傷，當(dāng)咬合力超過牙周組織的承受范圍時(shí)，就有可能造成牙周組織的損傷。上述因素均會(huì)引起口腔感染，繼而導(dǎo)致細(xì)胞自噬的激活。在脂多糖的刺激下LC3 蛋白表達(dá)增多，表明自噬增強(qiáng)，提示自噬可參與牙周炎的病理發(fā)展。但具體起著保護(hù)作用還是病理作用，尚無充分的證據(jù)證實(shí)，只能提示自噬與牙周炎相關(guān)。在熒光顯微鏡下觀察自噬形成，可見多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，故可采用計(jì)數(shù)法來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，在顯微鏡下可照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，從而觀察物體的形狀及其所在位置。臨床中熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡技術(shù)中，將標(biāo)記熒光素的純化肌動(dòng)蛋白顯微注射入樣本細(xì)胞中，可以將產(chǎn)生的綠色熒光蛋白基因與某種蛋白質(zhì)基因融合，便可直接在活體狀態(tài)下觀察到該蛋白在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。LC3 的熒光顯微鏡檢測(cè)方法仍存在一些缺陷，比如臨床還沒有建立起統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)技術(shù)路線，試驗(yàn)者執(zhí)行操作還不夠規(guī)范；檢驗(yàn)中熒光斑細(xì)胞比例和表達(dá)的量化路徑較缺乏。再比如定量單個(gè)細(xì)胞LC3 熒光斑的表達(dá)中，計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均熒光值中還沒有確切的量化標(biāo)準(zhǔn)；因?yàn)長(zhǎng)C3 熒光斑具有較高的時(shí)間依賴性，長(zhǎng)時(shí)間下可能會(huì)導(dǎo)致其蓄積，加之各種環(huán)境因素、操作技術(shù)均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，從而造成結(jié)果誤差。所以優(yōu)化相關(guān)檢測(cè)技術(shù)，深入研究更符合自噬生理學(xué)功能的檢測(cè)技術(shù)具有重要的意義。目前，越來越多的研究表明自噬會(huì)參與牙周病的發(fā)病機(jī)制，但LC3B、LC3Av1 在牙周病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步在相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探討分析。本研究的結(jié)果顯示，在脂多糖的刺激下，自噬相關(guān)蛋白LC3B、LC3Av1 的表達(dá)水平會(huì)明顯上調(diào)。這表明，自噬可參與牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程。

綜上所述，自噬相關(guān)蛋白在牙周病的發(fā)生發(fā)展中可影響炎性細(xì)胞的生成，且表達(dá)量隨炎癥發(fā)展而增加。臨床上仍需進(jìn)一步深入研究自噬與牙周病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，繼續(xù)探討牙周病發(fā)生發(fā)展中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及作用。