響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取桃膠多糖的工藝研究

何宇城，俞錳錳，韋艷雪，王 超，付 晨，陳豪羿，梅高翔，辛振麒，馬國榮，袁建鋒

（1. 浙江師范大學(xué)行知學(xué)院，浙江金華 321004；2. 浙江蘭溪錦榮生物科技股份有限公司，浙江金華 321004）

桃膠別名桃樹膠。桃、李等薔薇科植物的樹干受外力割傷，或者被微生物感染后，傷口處分泌的膠質(zhì)物即為桃膠。新鮮的桃膠顏色為淺紅色或者淺黃色，呈半透明狀。桃膠干燥后質(zhì)地由膠質(zhì)變?yōu)橘|(zhì)地堅(jiān)硬的固體，使用工具切割，可見切割面有光澤感[1]。桃膠中含有大量多糖，主要組成有鼠李糖、半乳糖、α - 葡萄糖醛酸等[2]，中醫(yī)認(rèn)為其具備益氣、活血、止渴之功效，也能降低血脂[3]。隨著研究的不斷深入，桃膠目前在化妝品、印染、化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域已有應(yīng)用[4]。

多糖的提取主要有溶劑提取法[5]、微波輔助提取法[6]、酶輔助提取法[7]、雙水相提取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、超濾法[10]、高壓脈沖法[11]等方法。超聲波提取法是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)，破碎桃膠的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，在短時(shí)間內(nèi)使其多糖擴(kuò)散到溶劑中。故采用超聲波輔助提取桃膠多糖，通過響應(yīng)面法確定其最佳工藝條件，以期為桃膠多糖提取產(chǎn)業(yè)化提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃膠，購自浙江金華磐安；3,5 -二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉、葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

JY92-ⅡN 超聲波細(xì)胞粉碎儀弄，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；料理機(jī)，美的集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品；Eppendorf centrifuge5810 R 型離心機(jī)，德國艾本德股份公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg 葡萄糖，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度；將其稀釋，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 梯度的葡萄糖待測(cè)液。再加入DNS 試劑5 mL，100 ℃下水浴反應(yīng)5 min，冷卻后定容至25 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定波長540 nm 處的吸光度。

1.3 桃膠的預(yù)處理

用料理機(jī)將購自浙江金華磐安的桃膠打成粉末，用80 目篩過濾，得到桃膠粉末。

1.4 桃膠多糖的提取

用蒸餾水按一定的料液比溶解桃膠粉末，在不同的超聲功率下提取相應(yīng)時(shí)間，離心得到上清液，加入6 mol/L 鹽酸，沸水浴條件下加熱1 h。冷卻后加蒸餾水稀釋，并且加入氫氧化鈉稀釋成中性，得桃膠多糖稀釋液。

1.5 單因素試驗(yàn)

為獲得桃膠多糖提取的最佳工藝，考查不同料液 比（1 ∶100，1 ∶150，1 ∶200，1 ∶250，1 ∶300）、超聲功率（125，150，175，200，225 W）、提取時(shí)間（10，15，20，25，30 min） 對(duì)桃膠多糖得率的影響。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

選取單因素試驗(yàn)中3 個(gè)最優(yōu)水平，構(gòu)建三因素三水平響應(yīng)面，優(yōu)化桃膠多糖提取工藝。

1.7 樣品多糖含量測(cè)定

運(yùn)用上述DNS 法，將提取液重復(fù)測(cè)定3 次，取3 次測(cè)得吸光度的平均值，然后代入線性方程計(jì)算出多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到方程Y=9.39X-0.037 6，R2=0.999。結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為0.02~0.10 mg/mL 時(shí)，與吸光度線性關(guān)系較好。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)桃膠多糖得率的影響

料液比對(duì)桃膠多糖得率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)桃膠多糖得率的影響

在提取功率200 W，提取時(shí)間15 min 的條件下，由圖2 可知，逐步增加料液比，桃膠多糖得率不斷提高，在料液比為1∶200 時(shí)，桃膠多糖得率最高。進(jìn)一步增加料液比，桃膠多糖得率下降?？赡苁沁^多的溶劑分散了超聲波對(duì)桃膠粉末的作用[12]。試驗(yàn)選取料液比1∶150，1∶200，1∶250（g∶mL） 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.2.2 超聲功率對(duì)桃膠多糖得率的影響

超聲功率對(duì)桃膠多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對(duì)桃膠多糖得率的影響

在料液比1∶200，提取時(shí)間15 min 的條件下，由圖3 可知，超聲功率為125~175 W，多糖得率隨著超聲功率的增加而增加，功率大于175 W 時(shí)，多糖得率略有下降。超聲波可使細(xì)胞壁破壞，利于多糖溶出，但當(dāng)超聲功率過高時(shí)，可能會(huì)引起局部溫度過高，導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，得率下降[13]。試驗(yàn)選取超聲功率150，175，200 W 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)桃膠多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)桃膠多糖收率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)桃膠多糖收率的影響

在料液比1∶200，提取功率200 W 的條件下，由圖4 可知，在10~20 min 時(shí)，多糖得率隨著時(shí)間的增加而增加，20 min 后得率下降?？赡苁且?yàn)檫^長時(shí)間的超聲會(huì)破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率下降。試驗(yàn)選取提取時(shí)間15，20，25 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化桃膠多糖的提取工藝

Box-behnken 中心組合試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析見表2。

表1 Box-behnken 中心組合試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析

對(duì)表3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型為：

二次模型的方差分析見表3。

表3 二次模型的方差分析

此模型的p值＜0.01，具有顯著性差異，說明該多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)擬合度較好。A2對(duì)得率有顯著性影響，C2對(duì)得率有極顯著影響。桃膠多糖得率受提取時(shí)間的影響最大，其次是料液比，最后是提取功率。

料液比和超聲功率對(duì)多糖得率的影響見圖5，料液比和超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖6，超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖7。

圖5 料液比和超聲功率對(duì)多糖得率的影響

圖6 料液比和超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖7 超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

通過Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝為料液比1∶203.5，超聲功率181 W，時(shí)間20.35 min 時(shí)，理論得率可達(dá)到83.97%。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面模型是否擬合較好，設(shè)置料液比1∶203.5，超聲功率181 W，超聲時(shí)間20.35 min 試驗(yàn)組，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得桃膠多糖得率為83.94%，與理論值較為接近，說明響應(yīng)面模型擬合度較高。

4 結(jié)論

以桃膠粉碎后的粉末為原料，通過3 個(gè)不同的因素（料液比、超聲功率和超聲時(shí)間） 來進(jìn)行響應(yīng)面法的優(yōu)化，最終得到了桃膠多糖提取工藝參數(shù)為料液比1∶203.5，超聲功率181 W，超聲時(shí)間20.35 min時(shí)，實(shí)際桃膠多糖得率可達(dá)到83.94%，為桃膠多糖提取工藝提供理論基礎(chǔ)。