無(wú)花果葉生物活性成分及總黃酮提取工藝研究進(jìn)展*

蘇學(xué)軍，徐 穎，宗春燕，錢佳

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

無(wú)花果又名紅心果、映日果，是一種耐瘠抗旱的桑科榕屬植物，喜生長(zhǎng)于熱帶及溫帶地區(qū)，其營(yíng)養(yǎng)和藥用功效顯著，在我國(guó)的新疆、江蘇、山東等地廣為栽培。無(wú)花果葉為無(wú)花果種植物的葉片，具有較高利用價(jià)值，不僅可作鮮食基料，采后曬干亦可入藥，《本草綱目》中描述無(wú)花果葉“甘微辛，平，有小毒”；《本草匯言》中記載其可以“去濕熱，解瘡毒”[1]。煮湯內(nèi)服可治腹瀉、喉疼，坐浴可治婦科炎癥、防治痔瘺，臨床可用于白癜風(fēng)和糖尿病的治療。無(wú)花果葉中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油、維生素、香豆素等多種生物活性成分，具有清除機(jī)體自由基、增強(qiáng)免疫力、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠等功效[2-4]。此外，無(wú)花果葉色素能用于棉織物的染色[5]，醇提物可開發(fā)成高效安全的天然食品保鮮劑[6]，無(wú)花果葉被發(fā)現(xiàn)可用于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治，對(duì)線蟲和蚜蟲顯示出強(qiáng)效的滅蟲活性[7]，對(duì)細(xì)菌性疾病亦有一定的防治效果。近年來(lái)，對(duì)無(wú)花果葉資源的綜合利用正引起人們的重視，本文針對(duì)無(wú)花果葉中的活性成分及總黃酮提取技術(shù)進(jìn)行總結(jié)和分析，期望為無(wú)花果葉資源的合理開發(fā)和應(yīng)用提供系統(tǒng)性參考。

1 無(wú)花果葉中的活性成分

1.1 黃酮類化合物

無(wú)花果葉中的黃酮類化合物主要有蘆丁、槲皮素、山奈酚、毛地黃黃酮等，不同地區(qū)、不同品種的無(wú)花果葉片中的黃酮含量相差甚大。相比于干葉及其它部位，鮮葉中的黃酮含量較高，可達(dá)19.8344mg·g-1[8]。無(wú)花果葉中的黃酮類化合物具有高度生物活性，有良好的抗氧化、降血糖、抑制皮膚老化等藥理作用。吳子江[9]將無(wú)花果葉醇提液先脫脂處理，再以乙酸乙酯萃取，大孔樹脂純化后，采用LS-ESI-MS 技術(shù)分析，共檢測(cè)到6 種類黃酮組分，且首次從中分離出芹菜素-3-C-阿拉伯糖-6-C-葡萄糖苷、芹菜素蕓香糖苷、山奈酚六碳糖苷3 種化合物。李申[10]采用HPLC-DPPH-MS 法對(duì)無(wú)花果葉乙酸乙酯萃取物進(jìn)行抗氧化成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)了11 種黃酮類化合物。

1.2 香豆素類

香豆素類物質(zhì)是一種以苯并α-吡喃酮為母核的內(nèi)酯型化合物，為無(wú)花果葉中的特異性成分，有鮮明的芳香氣味。無(wú)花果葉中的香豆素類物質(zhì)主要有補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)脂、傘形花內(nèi)酯等[11]，其中以補(bǔ)骨脂素含量居多。補(bǔ)骨脂素是一種具有光敏作用的天然產(chǎn)物，能夠用于治療白癜風(fēng)、銀屑病、對(duì)抗骨質(zhì)疏松、殺傷白血病細(xì)胞等，對(duì)多種癌細(xì)胞如胃癌、乳腺癌也被證實(shí)具有良好的抑制作用[8,12]。迪麗阿熱姆·尼加提等[13]選用Sunfire C18ODS 柱，乙腈-水作流動(dòng)相，在220nm 處以HPLC 法測(cè)定了無(wú)花果葉中傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素3 種香豆素的含量，分別為1.09、9.89、24.58mg·g-1。

1.3 多糖

多糖是無(wú)花果葉中含量較高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一種重要的藥用活性成分，主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖等組成。傳統(tǒng)技術(shù)是采用水提醇沉法提取無(wú)花果葉中的多糖，但此法提取耗時(shí)長(zhǎng)、需經(jīng)多次提取、效率低，因而研究者們開發(fā)出超聲波提取技術(shù)、微波提取技術(shù)、酶提取技術(shù)等與其聯(lián)用，以便達(dá)到省時(shí)、高效提取目的。王婷婷等[14]考察了超聲協(xié)同沸水法提取無(wú)花果葉片中的多糖工藝，經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，最佳工藝條件下獲得多糖得率為2.81%。無(wú)花果葉中的多糖藥用價(jià)值明顯，目前，已發(fā)現(xiàn)與抑制腫瘤、調(diào)節(jié)腸道功能及提高動(dòng)物免疫能力等有關(guān)。鄧佳麗等[15]研究表明，“布蘭瑞克”品種的無(wú)花果葉片對(duì)人體胃癌SGC-7901 增殖具有良好的抑制作用，癌細(xì)胞經(jīng)濃度為2mg·L-1的多糖處理，抑制率達(dá)到46.67%。無(wú)花果葉多糖能降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平，并對(duì)小鼠的臟器具有一定程度的保護(hù)作用[16]。

1.4 揮發(fā)油

揮發(fā)油是從無(wú)花果葉中提取出來(lái)的具有揮發(fā)性的油狀液體，主要成分為醇、酚、醛、酯、烴、酮、酸等。無(wú)花果葉中的揮發(fā)油作為一種多組分物質(zhì)，藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗腫瘤、清熱解毒、消炎驅(qū)蟲等功效。趙萍等[17]以水蒸氣蒸餾法從新鮮的無(wú)花果葉中提取揮發(fā)油，得率為0.56%，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析，共鑒定分離出19 種化合物，其中香豆素類占51.46%。為探索無(wú)花果葉中的揮發(fā)油成分，田景奎等[18]通過(guò)水蒸餾與乙醚超聲提取，兩種方法分別鑒定出26 種和37 種揮發(fā)性成分，相同組分共11 種，并證實(shí)補(bǔ)骨脂素在揮發(fā)油中占據(jù)較高比例。蘭艷素等人[19]通過(guò)超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)黃山無(wú)花果葉中的揮發(fā)油進(jìn)行提取，經(jīng)GC-MS 分析，共鑒定出68種化合物，含量最高的兩種組分為天然維生素E 和β-谷甾醇，其余相對(duì)含量較高的組分依次為反式角鯊烯、β-香樹脂醇、補(bǔ)骨脂素、亞麻酸和植醇。

1.5 其他成分

無(wú)花果葉中除含有上述活性成分外，還含有多酚、生物堿、花青素、苯甲醛、倍半萜類化合物、維生素、氨基酸、蛋白酶等重要成分。Takahashi T等[20]研究表明，無(wú)花果葉中含綠原酸、異槲皮素、咖啡酰蘋果酸多酚物質(zhì)。張雷等[21]以pH 值為7.8 的Na3PO4緩沖液處理無(wú)花果葉，粗酶液經(jīng)（NH4）2SO4分級(jí)、層析分離提純后得較高比活的超氧化物歧化酶。無(wú)花果葉中還含有生命活動(dòng)所需的多種微量元素，如Fe、Zn、Mg 等，并富含有機(jī)硒，含量高達(dá)0.12μg·g-1[22]。

2 無(wú)花果葉總黃酮的提取工藝

2.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法是讓提取劑與植物組織接觸，從中溶出目標(biāo)組分的一種單元操作方法。小分子醇、丙酮、乙酸乙酯是最常見的提取溶劑，根據(jù)"相似相溶"原理，考慮到目標(biāo)分子的極性，提取時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑的種類和濃度來(lái)改變提取劑的極性，促使植物細(xì)胞中黃酮最大限度地溶解到提取劑中。張慧婧[23]以品種為青皮的無(wú)花果鮮葉為原料，經(jīng)洗凈、干燥前處理后，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液作提取劑，控制料液比為1∶15（g∶mL），70℃水浴加熱回流提取5h，得到無(wú)花果葉中的總黃酮含量為2.60%。溶劑浸提法操作簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化提取，然而為保證提取效果，該法常需使用大量的石化溶劑，環(huán)保及后續(xù)溶劑回收壓力大，同時(shí)存在提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗高等缺點(diǎn)。

2.2 表面活性劑輔助提取

表面活性劑輔助提取是基于表面活性劑具有獨(dú)特的雙親結(jié)構(gòu)，能降低無(wú)花果葉與提取劑之間的界面張力，提高潤(rùn)濕程度，對(duì)于目標(biāo)物中不溶或難溶于水的黃酮類物質(zhì)，表面活性劑則可通過(guò)界面吸附或膠束增溶作用，增加這些組分的溶出，進(jìn)而獲得較為理想的萃取效率。孟瑤[11]以天然復(fù)配型表面活性劑結(jié)合微波技術(shù)提取無(wú)花果葉中的蘆丁等組分，經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，獲得的最佳工藝條件為：曲拉通100 與辛奎基葡萄苷按1∶3 復(fù)配，配制濃度為0.015mg·mL-1，在溶液pH 值為5，提取溫度40℃，提取時(shí)間10min，液固比為20∶1（mL∶g）條件下，得到蘆丁的平均提取率為5.27mg·g-1，高于傳統(tǒng)醇提法。利用濁點(diǎn)分離技術(shù)可對(duì)表面活性劑進(jìn)行富集和回收再利用，5 次循環(huán)使用后復(fù)合表面活性劑的回收率仍達(dá)80%以上。進(jìn)一步的研究表明，與常規(guī)水溶液提取相比，此法獲得的無(wú)花果葉提取物的穩(wěn)定性、抗氧化性及抗蟲性均有一定程度的增強(qiáng)。表面活性劑作為一種新型綠色、環(huán)保提取劑，具有使用量少、提取時(shí)間短、高效節(jié)能且可提高目標(biāo)組分穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為天然活性組分提取常用的溶液技術(shù)手段。

2.3 微波提取

微波提取是讓微波發(fā)生器產(chǎn)生穿透性極強(qiáng)的高頻電磁波（300MHz～300GHz），此電磁波可輕易穿透溶劑及植物細(xì)胞壁而抵達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞質(zhì)吸收熱能后，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生顯著的熱效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因內(nèi)壓過(guò)高而破裂，細(xì)胞內(nèi)的黃酮等組分得以快速溶出到溶劑中。崔鵬等[24]探索了微波法提取無(wú)花果葉中總黃酮的提取工藝，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得最佳參數(shù)為：微波功率200W，液料比（mL∶g）為55∶1，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，微波連續(xù)提取3min，總黃酮的得率為20.56mg·g-1。微波提取具有穿透力強(qiáng)，能夠直接作用于目標(biāo)物，并且微波獨(dú)特的內(nèi)加熱方式，十分有利于傳熱和傳質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行，因而相比于其他提取方法，微波提取具有能耗低、溶劑用量少、選擇性好、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，但微波作用的局限性，使物料中不可避免地存在有“過(guò)熱點(diǎn)”與“過(guò)冷點(diǎn)”，因而在規(guī)模提取時(shí)工藝的穩(wěn)定性常常難以滿足。

2.4 超聲提取

提取無(wú)花果葉黃酮的過(guò)程實(shí)質(zhì)上是將其從植物組織細(xì)胞中釋放出來(lái)，提取時(shí)需設(shè)法降低提取過(guò)程的阻力，提高溶劑的可及度，從而加速目標(biāo)組分的溶出。超聲波具有極強(qiáng)的空化作用，能使植物細(xì)胞壁發(fā)生瞬間破裂，在保持生物活性不變的情況下加速胞內(nèi)黃酮的釋放[25]。同時(shí)，超聲場(chǎng)引起固液界面間產(chǎn)生強(qiáng)烈的湍動(dòng)效應(yīng)，擴(kuò)散及滲透作用大大增強(qiáng)，提取劑更易抵達(dá)細(xì)胞深處，促成高效提取。蘇適等[26]利用超聲波輔助乙醇提取無(wú)花果葉總黃酮，經(jīng)響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化得最佳提取工藝為：當(dāng)超聲功率為200W時(shí)，選擇體積分?jǐn)?shù)為43%的乙醇，料液比（g∶mL）為1∶60，連續(xù)超聲提取42min，總黃酮提取率可達(dá)3.519%。若無(wú)花果葉粗粉以乙醇浸泡處理一段時(shí)間，再以超聲波輔助提取，只需提取一次便可達(dá)到較高提取率[27]。超聲提取時(shí)間短，可以節(jié)約提取溶劑，安全高效，能較好保留目標(biāo)物的生物活性，此外，還可與微波、雙水相等技術(shù)聯(lián)用提高提取率，但超聲提取存在空白區(qū)，超聲設(shè)備投資費(fèi)用高，不易推廣。

2.5 雙水相萃取

雙水相萃取是一種在保持生物活性方面擁有技術(shù)優(yōu)勢(shì)的新型液液分離技術(shù)，具體過(guò)程為目標(biāo)分子進(jìn)入雙水相體系后，由于電荷、形態(tài)、極性、濃度等不同[28]，在兩相中存在不同的分配系數(shù)，通過(guò)選擇合適的操作條件，打破分配平衡，使其不斷從一相富集于另一相，最終獲得令人滿意的萃取率。李申[10]先以纖維素酶水解無(wú)花果葉細(xì)胞壁，再以雙水相耦合超聲技術(shù)提取無(wú)花果葉中的黃酮，通過(guò)對(duì)乙醇-無(wú)機(jī)鹽組成的7 個(gè)雙水相體系篩選，結(jié)合相圖及分相情況，優(yōu)選出乙醇-（NH4）2SO4雙水相體系，并經(jīng)BBD 響應(yīng)面優(yōu)化得萃取參數(shù)為：液固比（mL∶g）為20∶1，超聲時(shí)間30min，體系中的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)38%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，總黃酮得率為60.22mg·g-1，遠(yuǎn)高于索氏抽提法的24.79mg·g-1。雙水相萃取法提取條件溫和，生物相容性好，可以連續(xù)化操作，更兼綠色安全、易集成、目標(biāo)組分不易失活等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的提取與分離領(lǐng)域應(yīng)用甚廣。

2.6 低共熔溶劑提取

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）是近年來(lái)開發(fā)的一種對(duì)環(huán)境友好、具有特殊性質(zhì)的新型綠色試劑，它是由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）按一定比例混合后經(jīng)一步加熱攪拌合成，溶液澄清、透明且穩(wěn)定。在提取時(shí)，DESs 通過(guò)與黃酮、多糖、酚類等活性組分形成分子間氫鍵，從而提高組分的溶解性，而HBA 與HBD 的不同組合與配比對(duì)這些活性組分具有不同的靶向性和溶解性，因而，可通過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化DESs 組分來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的高效提取。李洪亮等[29]以魯西北無(wú)花果葉為原料，使用n(氯化膽堿)∶n(丙三醇)=1∶2 的低共熔溶劑提取黃酮組分，單因素試驗(yàn)法優(yōu)化獲最佳工藝為：DESs 含水量30%，固液比（g∶mL）為1∶12，提取1.5h，無(wú)花果葉中的黃酮含量為27.9mg·g-1。選擇摩爾比為3∶3∶3 的甘油、木糖醇、D-（-）-果糖組成的DESs 可同時(shí)提取無(wú)花果葉中的5 種活性化合物，其中蘆丁提取率為5.207mg·g-1[30]。DESs 作為提取劑的優(yōu)勢(shì)是價(jià)廉易合成、低毒可降解、結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，對(duì)生物活性分子顯示出更理想的選擇性和溶解性，但后續(xù)再生工藝繁瑣，且提取過(guò)程中的傳質(zhì)效率也有待提高。

3 結(jié)語(yǔ)

無(wú)花果葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性成分，藥用價(jià)值顯著，目前，對(duì)無(wú)花果葉的活性成分、藥理作用等尚處于研究探索階段。黃酮作為無(wú)花果葉中重要的藥用成分，具有獨(dú)特的藥理作用，在食品、藥品、大健康產(chǎn)品領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用空間。近年來(lái)，新型、綠色、高效的提取技術(shù)為無(wú)花果葉黃酮的提取和應(yīng)用提供了可能。與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，采用新型溶劑和場(chǎng)外強(qiáng)化技術(shù)，不但能夠減少能耗，強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，在提高目標(biāo)物的溶解性同時(shí)，還能增加其穩(wěn)定性，減少環(huán)境污染。今后要進(jìn)一步加大無(wú)花果葉活性成分及藥理作用研究力度，還要繼續(xù)探索綠色高效的無(wú)花果葉黃酮提取工藝，充分發(fā)揮我國(guó)無(wú)花果葉資源豐富的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)無(wú)花果葉資源向更深層次的開發(fā)利用。