金雀異黃素微粒多糖載體研究進(jìn)展

江瓊芳，應(yīng) 浩，錢婉婷，江 林，柳張葳，李曼莉

（桂林旅游學(xué)院，廣西桂林 541006）

0 引言

金雀異黃素（Genistein，縮寫為Gen） 又名染料木黃酮，化學(xué)名為4′,5,7 - 三羥基異黃酮，是從豆科植物中提取的一種天然異黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、類雌激素、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]。因具有苦味、水溶性差、生物利用度低等缺陷，限制了其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[2]。為改善其生物活性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，利用合適的載體包封和輸送金雀異黃素已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

現(xiàn)有研究顯示，脂類、蛋白質(zhì)、糖類等材料均可當(dāng)作載體制備微米級、納米級的Gen 微粒，從而提高Gen 的水溶性和生物利用度，進(jìn)而改善其活性效應(yīng)[3]。以多糖為載體的Gen 微粒因具有較高生物相容性、生物可降解性和可再生性等特點(diǎn)，使其成為非常具有吸引力的Gen 包封和遞送載體。常用的Gen 微粒多糖載體有殼聚糖（CS） 及其衍生物、環(huán)糊精（CDs） 及其衍生物、淀粉、葡聚糖等。依據(jù)制備Gen 微粒所用多糖載體材料的不同，對Gen 微粒多糖載體的制備方法、特點(diǎn)及其對Gen 生物活性的影響進(jìn)行了綜述，并對Gen 微粒多糖載體的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 殼聚糖及其衍生物載體

殼聚糖（CS） 及其衍生物是一類具有親水性、生物相容性和無毒性的天然高分子材料，被廣泛應(yīng)用于Gen 等食品功能因子與藥物的輸送、組織工程和傷口愈合等方面[4]。利用殼聚糖及其衍生物為載體包封Gen 的方法主要有交聯(lián)法、離子誘導(dǎo)法和自組裝法等[5]，包封后可顯著提高微粒中Gen 的水溶性、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性，制成微粒尤其是納米化的Gen 微粒后還可使其中的Gen 在磷酸鹽緩沖液（PBS）、模擬胃腸液和動物血液等介質(zhì)中呈現(xiàn)良好的緩、控釋性能。

吳婉瑩等人[6]制備了微球口服膠囊制劑Gen-CS。微球膠囊中Gen 在小鼠體內(nèi)各臟器的濃度與普通膠囊相比降低較緩慢，可在較長時間內(nèi)使Gen 維持一定的濃度。普通膠囊Gen 在小鼠體內(nèi)分布以肝臟為主，微球膠囊Gen 以肺與脾臟為主，而在肝臟與腎臟的分布均減少。馮淑瑩等人[7]以CS 為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用乳化分散- 化學(xué)交聯(lián)法，制備了球形規(guī)整、平均粒徑2～4 μm 的微球Gen-CS。在CS和Gen 質(zhì)量比為4∶1，CS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，反應(yīng)介質(zhì)pH 值為11 的條件下微球載藥量為10.5%，包封率達(dá)52.5%，成球后藥物結(jié)晶度降低。體外累積釋放率純Gen 在5 h 可達(dá)45%，而微球在15 h 才釋放10%。同時，微球中Gen 釋放率受載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)、交聯(lián)時pH 值和釋放介質(zhì)pH 值的影響。王瑩等人[5]采用離子誘導(dǎo)法制備了粒徑為200～300 nm，包封率為37.1%，載藥量為9.3%的球形納米粒Gen-CS。Gen 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)并沒有因?yàn)橹瞥杉{米粒而發(fā)生變化。陳圓等人[8]進(jìn)一步研究顯示，該納米粒的體外釋放與介質(zhì)pH 值和離子濃度有關(guān)。純Gen 在介質(zhì)中呈線性釋放；納米粒子在釋放介質(zhì)中先快速釋藥，后緩慢釋放。Ibrahim S 等人[9]采用靜電紡絲法以3∶7（V∶V） 的CS 和聚乙烯醇制備了粒徑為60.51 nm 的納米纖維Gen-CS-PVA。納米纖維在體外（PBS） 具控釋效應(yīng)，對人成纖維細(xì)胞（W138） 無毒；在體內(nèi)可使脊髓受損雌性SD 大鼠脊髓組織中抗氧化酶活性增強(qiáng)，抗炎性細(xì)胞因子水平升高，而使促炎性細(xì)胞因子濃度下降，Gen-CS-PVA 納米纖維明顯提高了脊髓受損大鼠脊髓組織的抗氧化和抗炎癥能力[4]，為神經(jīng)組織炎癥性疾病的治療提供了新的思路。Rahmani F 等人[10]以物質(zhì)的量比為4∶1 的CS 和三聚磷酸鈉為原料，采用超聲攪拌的方法制備了粒徑為（788±3.45） nm，多分散指數(shù)為0.29，包封率達(dá)（76.8±14.69） %，呈球形的納米粒CHI-En/Gen。該納米粒對正常人皮膚成纖維細(xì)胞的活力無影響，卻能顯著抑制人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的生長和增殖，可使HT-29 細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)顯示該納米粒還具有抗血管生成活性。

Vanden Brabera N L 等人[11-12]以美拉德反應(yīng)制備的水溶性CS 衍生物（WSCh） 為載體包埋Gen，得到粒徑約為2.62 μm，包埋率為（78±5） %的微囊化MCGe。微囊中Gen 在體外模擬胃腸液條件下呈兩相釋放模式，體外抗氧化能力顯著高于純Gen。葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎雌性小鼠連續(xù)10 d 飼喂MCGe（0.08 mg/d），可顯著減輕小鼠結(jié)腸炎的癥狀。微囊化Gen 有望成為治療氧化性炎癥疾病的新選擇。

隨著研究的不斷深入，以殼聚糖為載體的Gen微粒通過與磁性材料、特定靶向配體等的結(jié)合，可提高Gen 在靶部位的聚集，進(jìn)而增強(qiáng)其對靶部位的活性效應(yīng)。目前，對這類靶向性Gen 微粒多糖載體的研究總體還較少。張龍等人[13]以CS、Fe3O4為主要原料，采用離子誘導(dǎo)法在優(yōu)化的條件下制備了具有磁性的Gen 靶向CS 納米粒子。微球粒徑在300～800 nm，具有良好的磁響應(yīng)性和體外緩釋性。Cai L等人[14]以葉酸（FA）、CS、Gen 為原料，制備了粒徑約為165 nm 的球形納米粒FGCN（含F(xiàn)A） 及GCN（不含F(xiàn)A）。2 種納米粒體外釋放曲線相似，對Gen有良好的控釋效應(yīng)。FGCN 對人宮頸癌HeLa 細(xì)胞的抑制能力和誘導(dǎo)凋亡能力要顯著強(qiáng)于GCN 和游離Gen。因葉酸與HeLa 細(xì)胞中大量存在的葉酸受體- α具有高度親和力，致使FGCN 與細(xì)胞間通過配體- 受體的特異結(jié)合，顯著提高了對HeLa 細(xì)胞的靶向性。

2 環(huán)糊精及其衍生物載體

環(huán)糊精（CDs） 是含有6 個單位α - 環(huán)糊精（α-CD）、7 個單位β- 環(huán)糊精（β-CD） 和8 個單位γ-環(huán)糊精（γ-CD） 并用α（1-4） 糖苷鍵連接的環(huán)狀寡糖。在各種CDs 中，β-CD 是更為常用的提高Gen 等食品功能因子與藥物水溶性的CDs。β-CD 分子的外部親水，內(nèi)部親脂，其錐形排列有助于其在不經(jīng)過任何化學(xué)修飾的情況下，通過非共價鍵的方式包封親脂分子，從而提高親脂分子的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度[15-16]。利用環(huán)糊精及其衍生物為載體包封Gen 的方法主要有酸堿中和法、溶劑蒸發(fā)法、濕揉制法和純研磨法等。經(jīng)上述方法有效包合后可顯著提高微粒中Gen 在水中的溶解度和溶出度、跨膜通透性、抗氧化和抗腫瘤等活性。

雷英杰等人[15]以β-CD 為載體，采用改良的酸堿中和法在Gen 和β-CD 物質(zhì)的量比為1∶1 時制備了包封率大于90%的包合物Gen-β-CD。該研究顯示，在β-CD 和Gen 的包合過程中出現(xiàn)了一種新的物相，即形成了Gen-β-CD 包合物。在飽和水溶液中，Genβ-CD 中Gen 含量（30 μg/mL） 為純Gen（2 μg/mL）的15 倍，即制成包合物后顯著提高了Gen 在水中的溶解度。Zafar A 等人[16]以1∶1∶0.05（W/W） 的Gen、β-CD 和TPGS 為原料，采用溶劑蒸發(fā)法制備了含Gen 的三元包合物GTTIC2。包合后結(jié)晶Gen 轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。包合物顯示出增強(qiáng)的穩(wěn)定常數(shù)和絡(luò)合效率，飽和溶解度包合物約為純Gen 的48.09 倍；體外模擬釋放率包合物為純Gen 的5.9 倍。在100 μg/mL質(zhì)量濃度下，包合物的DPPH 自由基清除率為純Gen的1.17 倍。對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度包合物只有純Gen 的60.15 %。即Gen 與β-CDs 和TPGS 的有效包合顯著增加了Gen 的溶解度、溶出度和體外抗氧化和抗腫瘤活性。該三元包合物的制備為提高以Gen 為代表的低可溶性藥物口服遞送效果提供了新的途徑。

Daruházi á E 等人[17]以不同的環(huán)糊精β-CD、γ-CD 及其衍生物2- 羥丙基-β-CD（HP-β-CD） 和隨機(jī)甲基-β-CD（RAMEβ-CD） 為載體，采用濕揉制的方法制備了呈固態(tài)、分子分散的Gen 環(huán)糊精及其衍生物包合物。相對純Gen，包合物顯著提高了Gen水溶性，且環(huán)糊精衍生物所形成包合物（Gen/HPβ-CD 和Gen/RAMEβ-CD） 的溶解度要高于環(huán)糊精所形成的包合物（Gen/β-CD 和Gen/γ-CD）。人結(jié)腸癌Caco-2 單層細(xì)胞通透性試驗(yàn)顯示表觀滲透系數(shù)和跨膜Gen 量，包合物均顯著高于純Gen，即Gen 與環(huán)糊精及其衍生物形成包合物后顯著地改善了Gen 膜滲透作用。Fumi C 等人[18]分別以HP-β-CD 和磺丁基- β - 環(huán)糊精鈉鹽（SBE- β-CD） 為載體，采用純研磨的方法制備了環(huán)糊精包封的Gen 固態(tài)復(fù)合物Gen/HP-β-CD 和Gen/SBE- β-CD，共同研磨形成復(fù)合物后顯著增強(qiáng)了Gen 的溶解度。3～6 μg/mL 處理72 h，純Gen 及其共研磨環(huán)糊精復(fù)合物降低了來自黏多糖貯積癥（MPS） 2 型和3 型患者成纖維細(xì)胞糖胺聚糖合成能力，且呈劑量依賴性；對正常成纖維細(xì)胞的增殖能力和乳酸脫氫酶活性沒有顯著影響。Gen 共研磨環(huán)糊精復(fù)合物可以作為遺傳性糖胺聚糖代謝異常疾病MPS 聯(lián)合治療的一部分。這種純研磨無溶劑、清潔的綠色化學(xué)Gen 微粒制備方法具有良好的發(fā)展前景。

3 其他多糖載體

除殼聚糖及其衍生物、環(huán)糊精及其衍生物可充當(dāng)Gen 微粒的多糖載體外，淀粉、凝膠多糖、葡聚糖等亦可作為Gen 的微粒載體。因多糖結(jié)構(gòu)上的差異性，致使他們在和Gen 包封時所采用的方法各不相同。這些多糖載體多被用作提高Gen 在水中的溶解度，保護(hù)Gen 在模擬消化道環(huán)境中的穩(wěn)定性和控制Gen 在模擬介質(zhì)中的釋放速率。

Cohen R 等人[19]以土豆直鏈淀粉（A） 和含直鏈淀粉高的玉米淀粉（HACS） 為原料，采用酸化堿溶液的方法與Gen 一起制備了粒徑為微米級的淀粉復(fù)合物Gen-A 和Gen-HACS。Gen-A 中Gen 含量顯著高于Gen-HACS。體外釋放研究顯示，2 種復(fù)合體在pH 值3～8 的范圍內(nèi)穩(wěn)定；在pH 值6.9 的PBS 中，復(fù)合體在30 ℃和50 ℃下穩(wěn)定，而在80 ℃時穩(wěn)定性較低。2 種復(fù)合物在模擬胃液條件下均表現(xiàn)出較高的Gen 滯留量；在胰酶溶液中的Gen 釋放量分別是PBS 溶液中的4.92 倍和2.32 倍。即淀粉包封后減少了Gen 在酸性胃環(huán)境中的降解，而卻能在胰酶溶液消化后釋放Gen。該方法制備的Gen 淀粉復(fù)合物可在模擬介質(zhì)中控制Gen 的釋放。Soleimanpour M 等人[20]以玉米淀粉為原料，制備了平均粒徑為105.4 nm的介孔淀粉。介孔淀粉與Gen 以1∶1（W/W） 包埋后，Gen 包封率達(dá)79.9 %，納米粒中Gen 在模擬胃腸道消化液溶出率要顯著高于游離Gen 粉末，釋放曲線呈典型的兩相釋放模式。

Lakshminarayanan R 等人[2]以凝膠多糖Curdlan 為載體，用4 種不同的方法制備了4 種微米級的Gen-Curdlan（GC） 復(fù)合物I～I(xiàn)V。在4 種復(fù)合物種，Gen的總量（mg/100 mg 干物質(zhì)） 復(fù)合物I（2.3） 顯著高于其他復(fù)合物II（1.8）、III（1.0） 和IV（1.8）。復(fù)合物改變了純組分的結(jié)晶性質(zhì)，Curdlan 和Gen 之間存在分子間相互作用。4 種GC 復(fù)合物中Gen 的釋放時間均可延長至72 h，且其中Gen 的釋放量在加入溶壁酶（Lyticase） 的模擬腸液中均高于在PBS（pH值6.9） 中的釋放量，而Curdlan 可在溶壁酶的作用下降解。即在裂解酶對Curdlan 的酶解作用下，GC復(fù)合物中Gen 的釋放增強(qiáng)。通過酶促降解載體而調(diào)節(jié)Gen 釋放的新型藥物緩釋系統(tǒng)為Gen 微粒體在食品和藥品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供了一種新的策略。Semyonov D 等人[21]以蔗糖為底物，用葡聚糖蔗糖酶酶促合成了葡聚糖球形納米粒，進(jìn)而包封形成葡聚糖包結(jié)的Gen 納米粒，其中Gen 含量可達(dá)5.6 g Gen/100 g納米粒。利用酶促合成Gen 微粒多糖載體的方法為利用葡聚糖的溶解性提高Gen 的溶解度和生物利用度提供了新途徑。Jangid A K 等人[22]以多糖菊粉、硬脂酸為原料，運(yùn)用薄膜水化法制備了載Gen、粒徑為115 nm，包封率達(dá)92.2 %的納米粒GNP。GNP 中Gen 在模擬胃腸液中的釋放具有位點(diǎn)特異性（胃中少，腸中多） 和明顯的緩、控釋效應(yīng)。處理人結(jié)直腸癌HCT 116 細(xì)胞48 h，GNP 的半數(shù)抑制濃度顯著低于純Gen 懸液。

4 結(jié)語

綜上所述，Gen 微粒多糖載體中研究相對較多的為殼聚糖（CS） 及其衍生物、環(huán)糊精（CDs） 及其衍生物，而對以淀粉、葡聚糖和凝膠多糖等為載體的Gen 微粒的研究則相對較少。多糖載體用于制備Gen 微粒的方法因所用多糖種類的不同而異。殼聚糖及其衍生物包封Gen 的方法主要有交聯(lián)法、離子誘導(dǎo)法和自組裝法等，也有用靜電紡絲和超聲攪拌等方法。環(huán)糊精及其衍生物包封Gen 的方法主要有酸堿中和法、溶劑蒸發(fā)法、濕揉制法和純研磨法等。

因淀粉、環(huán)糊精及其衍生物本身結(jié)構(gòu)的特殊性，通常以他們?yōu)檩d體的Gen 微粒的粒徑較大，多在微米級以上，而以殼聚糖、葡聚糖、菊粉等多糖為載體制備的Gen 微粒粒徑多為納米級的。多糖載體在與Gen 形成共包封物后，微粒中Gen 通常由結(jié)晶態(tài)向非晶態(tài)轉(zhuǎn)變，增加了Gen 在水中的溶解度和溶出速率，改善了微粒中Gen 在PBS、模擬胃腸液、血液等介質(zhì)中的釋放行為。同時，多糖包合物還能減輕胃刺激，增強(qiáng)Gen 在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，提高Gen 在體內(nèi)的生物利用度，并掩蓋Gen 的苦味。

當(dāng)前，以多糖為載體的Gen 微粒在改善Gen 性能方面的研究主要集中在多糖包合物中Gen 在體外介質(zhì)（如模擬胃腸液、PBS 等） 中的溶解度、溶出度和釋放機(jī)制等，而對Gen 多糖包合物在血液和動物體內(nèi)的釋放行為研究則較少。在改善Gen 生物活性效應(yīng)方面的研究主要集中在體外抗腫瘤和動物體內(nèi)抗炎癥方面：①抗腫瘤：多糖包合物在體外顯示出對人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、人結(jié)直腸癌HCT 116 細(xì)胞、人宮頸癌HeLa 細(xì)胞等顯著的抑制作用，其抗腫瘤的機(jī)制主要是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘使細(xì)胞凋亡和抗新生血管生成等。②抗炎：對小鼠體內(nèi)結(jié)腸炎和大鼠因脊髓受損所引起的神經(jīng)組織炎癥性疾病顯示出良好的治療作用，其抗炎癥的主要作用機(jī)制是促使體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)、抗炎性細(xì)胞因子水平升高、促炎性細(xì)胞因子水平下降等。此外，以多糖為載體的Gen 微粒還有體外抑制黏多糖貯積癥（MPS） 2 型和3 型患者成纖維細(xì)胞糖胺聚糖合成能力等生物活性效應(yīng)。目前，對以多糖為載體的Gen 微粒在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)、生物利用度、抗腫瘤及其機(jī)制等方面的研究還較少。

未來除了要加強(qiáng)以多糖為載體的Gen 微粒在動物體內(nèi)和臨床前試驗(yàn)研究外，制備納米化和具有靶向性的Gen 多糖包合物將是多糖載體包封Gen 極具前途的發(fā)展方向。納米化在縮小Gen 微粒體積的同時增加了藥物與細(xì)胞、組織的接觸面積，利于提高藥物的濃度；通過與Fe3O4等具有磁性的物質(zhì)結(jié)合和加入葉酸等配體物質(zhì)，可增強(qiáng)Gen 微粒在靶器官、靶組織的聚集，使藥物的靶向性增強(qiáng)，利于精準(zhǔn)化給藥，充分發(fā)揮Gen 的生物活性。大部分Gen 微粒多糖載體具有生物可降解、無毒的性質(zhì)，而且易于制備、重現(xiàn)性好和價格低廉，可與Gen 等疏水性物質(zhì)形成包合物。因此，以多糖為載體的Gen 微粒在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域極具發(fā)展前景。