碳點(diǎn)增敏的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中二氧化硫的含量

曹爍，曾鴻林，周佳欣，邵思遠(yuǎn)，劉豐睿，陳浩然，陳芳

華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，武漢 430074

二氧化硫是最常見的一種硫氧化物。在食品工業(yè)中，二氧化硫可作為食品添加劑發(fā)揮防腐、漂白、護(hù)色和抗氧化的作用。我國的國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品工業(yè)中二氧化硫的使用限量及殘留量有明確規(guī)定[1]。建立和完善相應(yīng)的分析檢測(cè)方法以保證二氧化硫在食品生產(chǎn)中的合理使用，有利于為食品衛(wèi)生和安全提供技術(shù)保障。測(cè)定食品中的二氧化硫的含量，國標(biāo)推薦的碘量法滴定是最常用的方法[2]。用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定酸化處理后的樣品，根據(jù)所消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液量計(jì)算出樣品中的二氧化硫含量。

碳點(diǎn)(Carbon dots，CDs)是一種準(zhǔn)球形的碳納米材料，21世紀(jì)初由美國克萊蒙森大學(xué)的科學(xué)家首次研制。它是一種與半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有相似光學(xué)性能的環(huán)境友好型熒光納米材料，具有細(xì)胞毒性低、生物相容性好、制備成本低廉、易于功能化修飾和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)，在生物標(biāo)記與細(xì)胞成像、光催化劑等領(lǐng)域均有應(yīng)用[3,4]。研究表明，碳點(diǎn)可以增敏一些體系的化學(xué)發(fā)光，如增敏魯米諾-過氧化氫體系以檢測(cè)葡萄糖[5]或雷尼替丁[6]，增敏魯米諾-高錳酸鉀體系用于檢測(cè)異萘酚[7]，以及增敏亞硫酸氫鈉-重鉻酸鉀體系測(cè)碘化物[8]含量等。

化學(xué)發(fā)光分析是一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度或者總發(fā)光量進(jìn)行分析檢測(cè)的方法。酸性高錳酸鉀氧化亞硫酸根時(shí)可以產(chǎn)生微弱化學(xué)發(fā)光，直接用于二氧化硫含量測(cè)定時(shí)靈敏度很低。通常可以加入有機(jī)熒光分子[9-11]、稀土配合物等[12,13]、納米材料[14,15]等作為增敏劑提高靈敏度。本文基于碳點(diǎn)可以敏化酸性KMnO4-Na2SO3體系的化學(xué)發(fā)光，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)建立了食品中亞硫酸鹽測(cè)定的方法。該實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙炎鳛槲倚１究粕鷦?chuàng)新實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，在讓學(xué)生掌握化學(xué)發(fā)光、流動(dòng)注射等分析技術(shù)的同時(shí)，學(xué)習(xí)科學(xué)研究的基本方法，提高思考能力。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 酸性KMnO4-SO32-體系化學(xué)發(fā)光及碳點(diǎn)增敏原理

酸性高錳酸鉀氧化亞硫酸根可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[16]。此反應(yīng)最初被用于二氧化硫和亞硫酸根的測(cè)定，還可以建立大氣環(huán)境中微量二氧化硫的高靈敏度檢測(cè)方法[17]。發(fā)光機(jī)理：發(fā)光體為激發(fā)態(tài)的二氧化硫，其發(fā)射波長(zhǎng)位于450-600 nm，反應(yīng)式如下：

該發(fā)光體系的量子產(chǎn)率低，發(fā)光強(qiáng)度弱，直接用于亞硫酸鹽檢測(cè)靈敏度很低。碳點(diǎn)加入后可作為催化劑有效加快體系中中間體或激發(fā)態(tài)物質(zhì)的生成速度，也能作為能量受體接受激發(fā)態(tài)中間體的部分或全部能量，或者直接作為發(fā)光體，大大增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。

1.2 流動(dòng)注射法

流動(dòng)注射分析，由Hansen和Ruzicka在1975年首次提出，是一種新型的定量流動(dòng)分析技術(shù)[18]。它可以在非平衡的狀態(tài)下，在液流中重現(xiàn)地處理樣品，并進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。蠕動(dòng)泵通過一定的速度將試樣和載流泵入管路，以六通閥給待測(cè)試劑定量，兩者在反應(yīng)器中混合同時(shí)發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)器檢測(cè)到響應(yīng)信號(hào)后，通過輸出裝置輸出信號(hào)。

在樣品通過分析流路時(shí)，以完全相同的方法順序處理所有的樣品，檢測(cè)器所記錄的是連續(xù)變化的信號(hào)(如：吸光度、電極電勢(shì))，因而不需要達(dá)到化學(xué)平衡(穩(wěn)態(tài)條件)。其中，準(zhǔn)確樣品體積的注入、精確重現(xiàn)的定時(shí)進(jìn)樣，以及從注入點(diǎn)到位測(cè)點(diǎn)體系完全相同的操作(即控制或可控分散)，形成注入樣品的濃度梯度，從而產(chǎn)生瞬間的、但可精確重現(xiàn)的記錄信號(hào)，使得流路中的任何一點(diǎn)都能像穩(wěn)態(tài)一樣準(zhǔn)確測(cè)量。

2 儀器與試劑

儀器：流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀(西安瑞邁PM-B)、靜態(tài)化學(xué)發(fā)光分析儀(本實(shí)驗(yàn)室自組裝化學(xué)發(fā)光暗箱，其中發(fā)光強(qiáng)度用R105型光電倍增管(購自北京濱松電子有限公司)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)信號(hào)采集用N2000型色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)、水熱反應(yīng)釜、烘箱。

試劑與材料：檸檬酸、乙二胺、高錳酸鉀、亞硫酸鈉、氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)、透析袋(截留分子量為1000 Da)、食品樣品(葡萄干、紅棗、燕麥片)。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

3.1 碳點(diǎn)的制備

碳點(diǎn)的制備方法參考文獻(xiàn)[19,20]，具體方法如下：在燒杯中加入1.0 g檸檬酸、2.0 mL水和300 μL乙二胺混合后轉(zhuǎn)移至內(nèi)膽為聚四氟乙烯的水熱反應(yīng)釜中，165 °C的反應(yīng)2.5 h。稀釋后轉(zhuǎn)移至截留分子量為1000 Da的透析袋中，透析48 h。透析后得到淡黃色透明溶液，置于4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 靜態(tài)化學(xué)發(fā)光測(cè)試

靜態(tài)化學(xué)發(fā)光測(cè)試采用實(shí)驗(yàn)室自制化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器。在反應(yīng)容器中加入1.00 mL 0.02 mmol·L-1的亞硫酸鈉溶液、1.00 mL 0.0204 mg·mL-1的碳點(diǎn)溶液并混合均勻，通過注射器注入1.00 mL的0.10 mmol·L-1的高錳酸鉀溶液，記錄發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系得到化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線。

3.3 流動(dòng)注射分析測(cè)試及條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

流動(dòng)注射化學(xué)測(cè)試儀器結(jié)構(gòu)如圖1所示，A泵驅(qū)動(dòng)載留水與高錳酸鉀溶液經(jīng)六通閥后交替流動(dòng)到管路中，B泵驅(qū)動(dòng)的亞硫酸鈉和碳點(diǎn)溶液混合，上述兩個(gè)溶液混合后流經(jīng)底部安裝有光電倍增管的檢測(cè)池。光電倍增管將發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，由電腦記錄下發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線。

圖1 流動(dòng)注射儀結(jié)構(gòu)以及進(jìn)樣示意圖

3.3.1 儀器參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中選擇對(duì)采樣速率、放大級(jí)數(shù)、光電倍增管的電壓、泵速與閥速這幾個(gè)儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過改變上述儀器參數(shù)的其中一個(gè)，固定其他參數(shù)，測(cè)試參數(shù)對(duì)發(fā)光信號(hào)的精細(xì)度、峰展寬、峰高以及峰面積的影響。

3.3.2 試劑適宜濃度的探索實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中采用的高錳酸鉀溶液的濃度、酸的種類和碳點(diǎn)的濃度都會(huì)對(duì)最后的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，故需測(cè)試上述條件對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。測(cè)試時(shí)將其他濃度固定不變，改變其中試劑濃度進(jìn)行測(cè)試。

3.4 樣品的前處理方法及測(cè)定

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣品是葡萄干、紅棗和燕麥片。將烘干的葡萄干、紅棗和燕麥片分別用料理機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取10.00 g粉碎后的樣品，加入30.0 mL 0.10 mol·L-1的NaOH混勻，超聲提取15 min后用高速離心機(jī)8000 r·min-1離心10 min，取上清液定容至50 mL，4 °C保存。為保證樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在定容之前不能有樣品損失。如果上清液不能完全轉(zhuǎn)移，可再加入水混合均勻并離心后再次轉(zhuǎn)移。分析時(shí)根據(jù)發(fā)光峰面積定量。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

4.1 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

采用靜態(tài)化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定體系在沒有增敏劑和加入碳點(diǎn)作為增敏劑時(shí)的發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果如圖2所示。在沒有增敏劑時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光很弱；加入碳點(diǎn)作為增敏劑后，體系的發(fā)光強(qiáng)度急劇增加。

圖2 有無碳點(diǎn)增敏條件下的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

4.2 儀器參數(shù)對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選取恰當(dāng)?shù)牟蓸铀俾?、放大?jí)數(shù)、光電倍增管高壓、泵速和閥速。下面針對(duì)重要的進(jìn)行說明。

4.2.1 光電倍增管電壓的影響

如圖3a所示，光電倍增管的電壓會(huì)影響峰高和基線信噪比。電壓過小，會(huì)導(dǎo)致發(fā)光峰很??；電壓過大則會(huì)導(dǎo)致基線噪音增加。本實(shí)驗(yàn)選用900 V為最佳電壓。

4.2.2 泵速的影響

泵速是指蠕動(dòng)泵每分鐘的轉(zhuǎn)速，會(huì)影響管路中液體的流動(dòng)速度。如圖3b所示，測(cè)定同一個(gè)樣品時(shí)，采用不同的泵速，峰面積基本不變，而泵速會(huì)影響峰的展寬。理論上泵速越快峰的寬度越小，就越容易分辨。

根據(jù)化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)，本實(shí)驗(yàn)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速度很快，因此較快的泵速將有利于兩個(gè)泵驅(qū)動(dòng)的溶液混合后能盡快到達(dá)檢測(cè)器上方，化學(xué)發(fā)光信號(hào)增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3b所示，化學(xué)發(fā)光信號(hào)增加泵速增加。但過快的泵速會(huì)導(dǎo)致儀器振動(dòng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用的泵速為40r·min-1。

圖3 (a)光電倍增管電壓對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響；(b)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響

4.3 反應(yīng)物濃度對(duì)發(fā)光的影響

4.3.1 碳點(diǎn)的濃度的影響

考察了碳點(diǎn)的濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4a所示。沒有碳點(diǎn)時(shí)體系發(fā)光強(qiáng)度很小，隨著碳點(diǎn)濃度增加，發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加。碳點(diǎn)濃度太大時(shí)，可能會(huì)發(fā)生猝滅作用，發(fā)光強(qiáng)度逐步降低。因此選擇發(fā)光強(qiáng)度最大的碳點(diǎn)濃度2.04 × 10-5mg·L-1開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 (a) 0.10 mmol·L-1的高錳酸鉀和0.10 mmol·L-1的亞硫酸鈉條件下碳點(diǎn)濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響；(b) 2.04 × 10-5 mg·L-1的碳點(diǎn)和0.10 mmol·L-1的亞硫酸鈉條件下高錳酸鉀濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響；(c)不同酸介質(zhì)下的檢測(cè)信號(hào)

4.3.2 高錳酸鉀濃度及其酸度的影響

高錳酸鉀是該化學(xué)發(fā)光體系的氧化劑，因此沒有高錳酸鉀時(shí)體系沒有化學(xué)發(fā)光，隨著高錳酸鉀的濃度增加，體系發(fā)光強(qiáng)度急劇上升(圖4b)。當(dāng)高錳酸鉀濃度大于0.10 mmol·L-1時(shí)，由于高錳酸鉀可能會(huì)吸收光，增加其濃度發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選用的高錳酸鉀的最佳濃度是0.10 mmol·L-1。酸介質(zhì)會(huì)影響高錳酸鉀的氧化性，因此考察了不同種類的酸對(duì)體系化學(xué)發(fā)光的影響以及不額外加酸的情況對(duì)峰的影響(圖4c)。結(jié)果表明采用pH為1.55的H2SO4介質(zhì)時(shí)發(fā)光峰面積大且峰形規(guī)整，所以用的0.081 mol·L-1的硫酸作為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的條件。

4.4 方法的分析性能及樣品測(cè)定

4.4.1 方法的分析性能

圖5a和b分別是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，不同亞硫酸鈉濃度的發(fā)光信號(hào)及亞硫酸鈉測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)光強(qiáng)度與亞硫酸鈉的濃度在1.0 × 10-5-2.5 × 10-4mol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為I = 218 +39.8 × 106c (mol·L-1)，檢出限為7.79 × 10-6mol·L-1。對(duì)濃度為3.0 × 10-5mol·L-1的亞硫酸鈉平行測(cè)定5次，RSD為3.8%。

4.4.2 樣品中二氧化硫的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。葡萄干、紅棗、燕麥片中的二氧化硫含量分別為34.78、38.9和41.4 mg·kg-1，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)[1]。采用加標(biāo)回收法驗(yàn)證分析方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表1所示，加標(biāo)回收率在86.2%-101.3%之間。

圖5 (a)亞硫酸鈉測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)不同濃度亞硫酸鈉的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度圖

表1 樣品亞硫酸鹽測(cè)定結(jié)果及回收率

4.5 碳點(diǎn)增敏機(jī)理討論

根據(jù)文獻(xiàn)[16,21,22]可知，酸性Na2SO3-KMnO4體系中發(fā)光體是激發(fā)態(tài)二氧化硫SO2*。另有文獻(xiàn)報(bào)道高錳酸鉀可氧化CdS量子點(diǎn)，發(fā)出量子點(diǎn)在520 nm的熒光[23]。此外，有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)氧化劑存在的條件下，碳點(diǎn)很容易被氧化劑注入空穴或電子，成為發(fā)光體[24]。在結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)[25]，本實(shí)驗(yàn)的NCDs-Na2SO3-KMnO4體系中發(fā)光體有兩個(gè)：SO2*和激發(fā)態(tài)的氧化碳點(diǎn)，NCDs在該發(fā)光體系中有催化劑和發(fā)光體雙重身份。

5 思考題

(1)為什么蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速會(huì)影響流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度？流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光檢測(cè)到的信號(hào)與靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)信號(hào)有何不同？

(2)同為發(fā)光分析方法，與熒光分析方法相比，化學(xué)發(fā)光分析有何特點(diǎn)？?jī)x器構(gòu)造有什么不同？

(3)為保證樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在樣品前處理過程中需要注意什么？在樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容之后需要注意什么？

(4)本實(shí)驗(yàn)中采用什么方法驗(yàn)證分析方法的準(zhǔn)確性？還有哪些方法常用于驗(yàn)證分析方法的準(zhǔn)確性？

6 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)及教學(xué)組織運(yùn)行方式

6.1 教學(xué)組織運(yùn)行方式

本實(shí)驗(yàn)屬于儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)，涉及到儀器分析課程中的化學(xué)發(fā)光分析法、流動(dòng)注射進(jìn)樣技術(shù)和納米材料的制備，適合在化學(xué)類專業(yè)高年級(jí)開設(shè)。建議分4個(gè)環(huán)節(jié)開展實(shí)驗(yàn)：1)課外預(yù)習(xí)，自主學(xué)習(xí)流動(dòng)注射技術(shù)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案；2)實(shí)驗(yàn)方案討論，確定方法建立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、儀器參數(shù)設(shè)置、試劑濃度確定等具體內(nèi)容；3)實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)，期間需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本環(huán)節(jié)可以設(shè)置為8-24個(gè)學(xué)時(shí)；4)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及成果匯報(bào)PPT，分享實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)，教師點(diǎn)評(píng)總結(jié)，知識(shí)鞏固。

6.2 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)主要讓學(xué)生學(xué)習(xí)了化學(xué)發(fā)光分析方法，掌握流動(dòng)注射進(jìn)樣技術(shù)。通過儀器參數(shù)的優(yōu)化，學(xué)習(xí)化學(xué)發(fā)光的特性、儀器構(gòu)造、流動(dòng)注射裝置、光電倍增管的響應(yīng)特點(diǎn)等；通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，理解化學(xué)發(fā)光的原理及其影響因素；通過樣品測(cè)定，學(xué)習(xí)常規(guī)的樣品前處理技術(shù)；通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)分析方法準(zhǔn)確性的驗(yàn)證。學(xué)生基于本實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)到了我校的大學(xué)生創(chuàng)新研究項(xiàng)目。

7 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)采用酸性高錳酸鉀-亞硫酸鹽化學(xué)發(fā)光體系，以廉價(jià)環(huán)保的碳量子點(diǎn)為增敏劑，建立了一種流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光的分析方法用于葡萄干、紅棗、燕麥片等食品中二氧化硫含量的測(cè)定。通過該實(shí)驗(yàn)可幫助學(xué)生掌握在同類高校中開設(shè)較少的化學(xué)發(fā)光、流動(dòng)注射等分析技術(shù)的原理及應(yīng)用，深入理解化學(xué)發(fā)光的原理和特性，學(xué)習(xí)樣品前處理技術(shù)和分析方法準(zhǔn)確性的驗(yàn)證方法。