基于Wnt/β-catenin信號通路探討川芎提取物對慢性心力衰竭大鼠的干預作用Δ

高 嘉，黃冀娜，李 珍(保定市第二醫(yī)院心血管內科，河北 保定 073000)

慢性心力衰竭(chronic heart failur，CHF)是由于心肌梗死、心肌病、血流動力學負荷過重及炎癥等原因引起的心肌損傷，患者臨床表現(xiàn)主要為活動或生氣時出現(xiàn)呼吸困難，還會出現(xiàn)消化不良、腹脹等癥狀[1-2]。川芎提取物是傘形科植物川芎根莖的提取物，可以抑制炎癥反應、調控細胞凋亡、改善血管收縮功能，治療心力衰竭[3-4]。Wnt信號通路可促進核內惡性腫瘤相關基因轉錄調節(jié)分子，其功能最常見于胚胎發(fā)育和惡性腫瘤，決定細胞的分化命運。Wnt/β-catenin信號通路也參與心臟重要的生物學進程，心臟受損后，Wnt/β-catenin信號促進心臟成纖維細胞的纖維化、瘢痕形成和有害心肌擴張[5-6]。本研究將通過誘導大鼠CHF模型，探討川芎提取物對CHF大鼠的干預作用，并探究Wnt/β-catenin信號通路的變化，為臨床使用川芎提取物治療及輔助治療CHF提供分子基礎和依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性8～10周齡SPF級SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物中心。

1.2 儀器

Leica RM2015型切片機(德國Leica公司)；-80 ℃超低溫保存箱(美國Thermo公司)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Western blot電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 藥品與試劑

川芎提取物購自廣州朋遠化工有限公司(批號：20150412，-20 ℃避光保存，使用時用2%吐溫80先溶解，再用0.9%氯化鈉溶液稀釋，終濃度為5 mg/mL；戊巴比妥鈉(批號：020919)購自天津市申泰化學試劑有限公司；蘇木精(批號：H9627)、伊紅(批號：861006)購于美國Sigma公司；去水平段極性蛋白3(Dvl3)抗體 (ab76081)、糖原合成酶激酶-3(GSKβ)抗體 (ab185141)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(ab32572)和二抗(ab150113)購于美國Abcam公司。

2 方法

2.1 大鼠分組及飼養(yǎng)條件

8～10周齡雄性SD大鼠于SPF級鼠房飼養(yǎng)，室溫調節(jié)在(25±2)℃，相對濕度40%～65%，12 h/12 h晝夜交替照明，自由攝取食物和飲用水，適應性飼養(yǎng)1周后造模。

2.2 大鼠CHF模型的建立

大鼠稱重后按10%水合氯醛0.4 mL/100 g行腹腔注射麻醉，將大鼠以背位固定于鼠板上，氣管插管后將針形心電圖導聯(lián)電極刺入大鼠四肢，觀察并記錄心電圖，暴露左側胸腔，于左側第3—4肋間開胸，逐層分離筋膜、肌肉，打開大鼠胸膜，擠壓大鼠右側胸腔，托舉心臟，鈍性撕開心包膜，于距離左冠狀動脈前降支起點2 mm處用縫線結扎前降支，并予以利多卡因注射液0.1 mL防止發(fā)生室性心律失常。結扎結束后縫合，觀測心電圖可見ST段明顯抬高，說明結扎成功。造模后半量飼料饑餓喂養(yǎng)，并對大鼠進行每日力竭式游泳1次[7]。

2.3 大鼠分組及給藥

隨機選擇CHF大鼠20只，分為模型組和實驗組。取10只未造模大鼠作為對照組。實驗組大鼠使用川芎提取物(100 mg/kg)干預，1日1次，連續(xù)干預4周。對照組和模型組大鼠分別給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

2.4 大鼠心臟蘇木精-伊紅(HE)染色

取出各組大鼠心臟后，對組織進行包埋后切片，進行脫蠟覆水，以蘇木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊紅染色1 min，脫水：70%、80%、90%和100%酒精各10 s，二甲苯1 min，通風櫥自然晾干再封片，于顯微鏡下進行檢查[8]。

2.5 大鼠心肌組織超微結構觀察

取各組大鼠左室心尖心臟組織，置于4%戊二醛固定液中，固定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，1%鋨酸固定，PBS清洗2次，脫水，包埋后制備心肌超薄切片，厚度50 nm，采用枸櫞酸鉛-醋酸鈾雙重染色后，經(jīng)透射電鏡觀察大鼠心肌組織超微結構[9]。

2.6 大鼠實驗終點心率及呼吸頻率檢測

實驗終點采用大/小鼠脈搏血氧呼吸監(jiān)護儀對各組大鼠心率及呼吸頻率進行檢測。測量時，保持室溫在22～26 ℃，每次測量前，打開大鼠固定裝置的電源開關，預熱15～20 min，達到設定溫度時加熱燈泡自動熄滅，溫度下降時燈泡自動開啟，維持加熱板在39～40 ℃；將待測大鼠放入預熱箱中固定，露出尾部，安裝袖帶及光電容積搏動傳感器，檢測心率。呼吸頻率采用注射麻醉，仰臥固定，記錄呼吸頻率。

2.7 大鼠實驗終點大鼠左心室舒張末期內徑(LVIDd)、左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室射血分數(shù)(LVEF)和左心室縮短分數(shù)(LVFS)檢測

大鼠麻醉采用5%戊巴比妥鈉(以0.9%氯化鈉溶液溶解過濾)麻醉 4 min后立即檢測；檢測：通過M型超聲心功能的測定儀檢測大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS。

2.8 蛋白質印跡法檢測大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ和β-catenin蛋白的表達

對各組大鼠心臟進行研磨，采用RIPA蛋白裂解液心臟細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，80 V、15 min，120 V、2 h，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉模120 V、2.5 h，TBST漂洗3次(每次10 min)，使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗3次(每次10 min)，加入一抗，二抗溫孵育后，TBST漂洗3次(每次10 min)，超敏化學發(fā)光液顯色，發(fā)光儀曝光、拍照[10-11]。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 CHF大鼠造模前后心電圖變化情況

大鼠CHF造模前心電圖表現(xiàn)為P波及PR間期明顯，R波降支與T波相交；大鼠CHF大鼠造模后心電圖顯示T波低平或倒置明顯，ST段較術前明顯抬高或下降(絕對值≥0.1 mV)，見圖1。

圖1 CHF大鼠造模前后心電圖比較Fig 1 Comparison of ECG in rats with chronic heart failure before and after modeling

3.2 CHF大鼠心臟HE染色比較

對照組大鼠心臟組織切片排列有序、細胞規(guī)則，心臟結構完整，未見明顯細胞損傷；模型組大鼠細胞腫脹，心臟細胞邊界不清晰，模糊，心肌細胞受損傷嚴重；實驗組大鼠心臟損傷相對于模型組有明顯改善，見圖2。

圖2 各組大鼠心臟HE染色情況比較(×200)Fig 2 Comparison of HE staining in heart of rats in each group (×200)

3.3 CHF大鼠心臟超微結構比較

對照組大鼠心肌細胞排列整齊，胞核及胞膜清晰，明暗帶界限清，線粒體膜結構清晰，數(shù)量豐富，基質排列緊密，線粒體內脊形態(tài)清晰可見，同時糖原顆粒完整，整體上細胞間質也無水腫；模型組大鼠心肌排列紊亂，纖維斷裂、消失，細胞間質出現(xiàn)水腫，線粒體數(shù)量減少且腫脹，線粒體內脊紊亂甚至消失；實驗組大鼠心肌纖維結構較模型組均有改善，水腫有所減輕，糖原數(shù)量有所增加，線粒體空泡化相比與模型組有所改善，見圖3。

圖3 各組大鼠心臟超微結構比較(×10 000)Fig 3 Comparison of cardiac ultrastructure of rats in each group(×10 000)

3.4 各組大鼠實驗終點心率及呼吸頻率比較

模型組大鼠的心率和呼吸頻率顯著高于對照組，實驗組大鼠的心率和呼吸頻率顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠實驗終點心率及呼吸頻率比較次/min)Tab 1 Comparison of heart rate and respiratory rate of rats in each group at the end of experiment

3.5 各組大鼠實驗終點LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比較

模型組大鼠的LVIDd、LVIDs顯著高于對照組，LVEF、LVFS顯著低于對照組；實驗組大鼠的LVIDd、LVIDs顯著低于模型組，LVEF、LVFS顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠實驗終點LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比較Tab 2 Comparison of LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS in each group at the end of experiment

3.6 各組大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ及β-catenin蛋白表達水平比較

與對照組相比，模型組大鼠Dvl3、GSKβ和β-catenin表達水平有上升趨勢；實驗組大鼠Dvl3、β-catenin顯著高于對照組，而實驗組相比于模型組有顯著下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

*P<0.05，**P<0.01；*P<0.05，**P<0.01圖4 各組大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ及β-catenin的蛋白表達水平Fig 4 Protein expression levels of Dvl3, GSKβ and β-catenin in heart tissues of rats in each group

4 討論

CHF指持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，是各種病因所致心臟疾病的終末階段，其主要特點為呼吸困難、水腫和乏力，一般均有代償性心臟擴大或肥厚及其他代償機制參與，常伴有靜脈壓升高導致的器官充血性病理改變，可有心房、心室附壁血栓和靜脈血栓形成，均可造成心肌結構和功能的變化，最后導致心室泵血和充盈功能低下[12-13]。川芎常用于活血行氣、祛風止痛，其提取物成分主要為川芎嗪、黑麥草堿、川哚、藁本內酯和洋川芎醌等，具有辛散、解郁、通達及止痛等功能[14]。本研究通過結扎左冠狀動脈前降支和竭力式游泳建立大鼠CHF模型，并給予大鼠川芎提取物干預，探究川芎提取物對大鼠心力衰竭的干預作用。結果表明，川芎提取物可以顯著降低大鼠心臟組織的損傷，提高心肌組織線粒體結構的恢復。線粒體占心肌細胞中體積的35%～40%，心肌活動所需95%的腺苷三磷酸(ATP)均由線粒體產(chǎn)生。本研究結果提示，川芎提取物可以逆轉線粒體受損，促進維持線粒體正常功能，進而部分恢復受損的心臟功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，川芎提取物可以降低CHF引發(fā)的呼吸急促，緩解心率增快的病癥，穩(wěn)定大鼠的心肺功能。本研究通過進一步比較LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平，證實了川芎提取物能夠改善大鼠心肌細胞收縮功能，起到恢復心臟功能、降低心臟損傷的作用。

Wnt/β-catetin信號通路是經(jīng)典的Wnt信號通路，在進化過程中高度保守。Wnt/β-catetin由Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8激活，并參與轉化。Wnt信號可通過上調Caspase抑制劑Survivin等抗凋亡蛋白來阻止細胞凋亡，并通過上調血管內皮生長因子來刺激血管生成。一些能夠降解細胞外基質的蛋白酶，如供應基質裂解蛋白、基質金屬蛋白酶(MMP)7和MMP26，以及細胞黏附分子，如CD44和NrCAM，都是Wnt的靶基因，并且可以促進腫瘤的侵襲和轉移。心臟受損后，Wnt/β-catenin信號同時參與心臟成纖維細胞的纖維化、瘢痕形成和有害心肌擴張，同時Wnt信號通路參與心肌梗死后心肌組織愈合過程的調控，參與心臟發(fā)育和心肌誘導分化等重要過程[15-16]。本研究結果表明，CHF大鼠的Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子Dvl3、GSKβ和β-catenin表達水平顯著升高，而川芎提取物干預后，Dvl3、GSKβ和β-catenin表達水平顯著降低；同時，川芎提取物干預后Dvl3、β-catenin水平仍高于對照組，而GSKβ水平與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示川芎提取物對Dvl3、β-catenin的調控作用弱于對GSKβ的調控作用。GSKβ是進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以使磷酸基團加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，磷酸化的β-catenin被蛋白酶體降解，從而導致β-catenin表達水平降低?？傮w上，本研究推測，川芎提取物可以逆轉CHF引發(fā)的Wnt/β-catenin激活，從而起到心臟保護作用。

綜上所述，川芎提取物對CHF大鼠的心臟有保護作用，其作用機制與Wnt/catanin信號通路的抑制有關。