澳洲茄堿通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的研究Δ

劉英琦，施 喆，孫樹剛#，周麗媛，楊 勇，王曉輝(.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 邯鄲056000； .河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，河北 邯鄲 056000)

原發(fā)性肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要包括肝細(xì)胞肝癌、膽管癌、肝母細(xì)胞瘤以及其他罕見(jiàn)類型的肝癌，其中肝細(xì)胞肝癌是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的類型，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌在全球腫瘤相關(guān)性死亡中居第2位[1]。澳洲茄堿提取自中藥龍葵，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿具有廣泛抗腫瘤作用，如膀胱癌、膽管癌以及肺癌等[2-4]。Liu等[5]的研究結(jié)果表明，澳洲茄堿可在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞分化和凋亡，已有研究結(jié)果表明，該信號(hào)通路在肝癌中活化，ERK特異性抑制劑可減弱肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[6]。因此，本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討澳洲茄堿是否能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物行為學(xué)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 儀器

SpectraMax iD5型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；CKX53型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；OPTIMA XPN型低溫超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；311型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.3 試劑

澳洲茄堿(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0620)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：M2003-1G)；超敏型BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P0012S)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：6140079和12634010)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司，批號(hào)：356234)；MAPK/ERK信號(hào)通路激活劑異丙腎上腺素(ISO，美國(guó)MCE公司，批號(hào)：HY-12028)；兔抗人磷酸化絲裂原激活的蛋白激酶激酶(p-MEK)、絲裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)和ERK抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab278716、ab195037、ab192591和ab32537)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞密度>80%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法測(cè)定澳洲茄堿對(duì)細(xì)胞存活率的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，采用不同濃度澳洲茄堿處理(0、10、20、30、40和50 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，加MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加二甲基亞砜100 μL，振蕩15 min，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=藥物處理組A值/對(duì)照組A值×100%。取濃度為50 μmol/L的澳洲茄堿用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT法測(cè)定各藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，隨機(jī)分為對(duì)照組、澳洲茄堿組、激動(dòng)劑組以及激動(dòng)劑+澳洲茄堿組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，澳洲茄堿組細(xì)胞用50 μmol/L澳洲茄堿處理24 h，激動(dòng)劑組細(xì)胞用ISO處理24 h，激動(dòng)劑+澳洲茄堿組細(xì)胞用激動(dòng)劑處理24 h后，50 μmol/L澳洲茄堿處理24 h。參照“1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

按照“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，各藥物處理24 h后，將細(xì)胞制成5×103的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，使用100 μL無(wú)菌槍頭垂直培養(yǎng)板底部均勻劃線，以磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞碎片清洗掉，加入新的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下拍照，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率(%)=(0 h細(xì)胞劃痕距離-24 h細(xì)胞劃痕距離)/0 h細(xì)胞劃痕距離。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

按照“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，各藥物處理24 h后，將細(xì)胞制成5×103的細(xì)胞懸液。將150 μL細(xì)胞懸液接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室中，下室則加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，濕棉簽將未侵襲細(xì)胞擦去，多聚甲醛固定小室20 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取3～5個(gè)視野拍照。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白表達(dá)

按照“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，各藥物處理24 h后，預(yù)冷PBS清洗3次，加入RIPA裂解，離心取上清液，采用蛋白定量試劑盒(BCA法)測(cè)定蛋白濃度，煮沸使蛋白質(zhì)變性。進(jìn)行凝膠電泳，濃縮膠每孔加入蛋白樣品20 μL，設(shè)置電泳儀參數(shù)為120 V、2 h。電泳結(jié)束后，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。Tris鹽緩沖液(TBS)加入Tween-20制成的等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗膜，室溫(25 ℃)封閉1 h，p-ERK、p-MEK、ERK、MEK和GAPDH抗體(1∶ 1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶ 5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，超敏化學(xué)發(fā)光液顯色，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度澳洲茄堿對(duì)細(xì)胞存活率的影響

與0 μmol/L澳洲茄堿比較，10、20、30、40及50 μmol/L澳洲茄堿均可降低細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且具濃度依賴性，見(jiàn)圖1。

與0 μmol/L澳洲茄堿組相比，aP<0.05；與10 μmol/L澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與20 μmol/L澳洲茄堿組相比，cP<0.05；與30 μmol/L澳洲茄堿組相比，dP<0.05；與40 μmol/L澳洲茄堿組相比，eP<0.05vs. 0 μmol/L solanine group, aP<0.05; vs. 10 μmol/L solanine group, bP<0.05; vs. 20 μmol/L solanine group, cP<0.05; vs. 30 μmol/L solanine group, dP<0.05; vs. 40 μmol/L solanine group, eP<0.05圖1 不同濃度澳洲茄堿對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of solanine

2.2 不同藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

四組細(xì)胞存活率比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，澳洲茄堿組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組與激活劑組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05Note: vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖2 不同藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig 2 Effects of different drugs on cell viability

2.3 不同藥物對(duì)細(xì)胞劃痕愈合率的影響

四組劃痕愈合率比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，澳洲茄堿組劃痕愈合率降低，激活劑組劃痕愈合率升高(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組劃痕愈合率升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組劃痕愈合率降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力Fig 3 Migration ability of cells detected by scratch test n=3)

2.4 不同藥物對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

四組侵襲細(xì)胞數(shù)比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，澳洲茄堿組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，激活劑組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖4 結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力Fig 4 Cell invasion ability detected by crystal violet staining (×200, n=3)

2.5 不同藥物對(duì)細(xì)胞中各蛋白表達(dá)的影響

四組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，激活劑組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ERK和MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中p-ERK、ERK、p-MEK和MEK蛋白表達(dá)情況Fig 5 Protein expressions of p-ERK, ERK, p-MEK and MEK in cells detected by Western blotting n=3)

3 討論

肝癌早期不易發(fā)現(xiàn)，且診斷困難，肝癌細(xì)胞對(duì)放化療不敏感，臨床上常采用手術(shù)治療，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且5年生存率僅約10%，因此，探索肝癌發(fā)生機(jī)制以及尋找有效的治療藥物對(duì)臨床治療肝癌具有重大而深遠(yuǎn)的意義[7]。澳洲茄堿是糖苷生物堿。Zhang等[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可通過(guò)上調(diào)微小RNA(miR)-486-5p表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。Wang等[9]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路，可抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。已有研究結(jié)果表明，澳洲茄堿可誘導(dǎo)HepG2和Hep3b肝癌細(xì)胞凋亡[10]。但其具體機(jī)制尚不清楚。此外，Jin等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4誘導(dǎo)的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的破壞，促進(jìn)肝癌細(xì)胞鐵死亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。本研究旨在探討澳洲茄堿對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。

本研究采用不同濃度澳洲茄堿處理肝癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，與0 μmol/L澳洲茄堿比較，不同濃度澳洲茄堿均可降低細(xì)胞存活率，表明澳洲茄堿具有抗肝癌作用。ERK/MAPK信號(hào)通路參與多種腫瘤細(xì)胞惡性增殖[12-13]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p通過(guò)激活ERK/MAPK正反饋環(huán)路促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展[14]。肺癌A549細(xì)胞中ERK/MAPK信號(hào)通路活化，抑制p-ERK1/2表達(dá)可減弱A549細(xì)胞的侵襲遷移能力[15]。He等[16]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA NPSR1-AS1通過(guò)使ERK1/2發(fā)生磷酸化，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，NPSR1-AS1沉默則抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，發(fā)揮抗肝癌作用。Wang等[17]的研究結(jié)果表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01503通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性生物行為學(xué)。本研究為了進(jìn)一步探索澳洲茄堿是否通過(guò)ERK/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用，采用ERK/MAPK信號(hào)通路激活劑ISO激活該信號(hào)通路后給予澳洲茄堿處理。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，激活劑組劃痕愈合率升高，侵襲細(xì)胞數(shù)增多；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組細(xì)胞存活率和劃痕愈合率均降低，侵襲細(xì)胞數(shù)減少；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組細(xì)胞存活率和劃痕愈合率均升高，侵襲細(xì)胞數(shù)增多。表明ERK/MAPK信號(hào)通路激活增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力。

MAPK信號(hào)通路參與多種生理病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[18]。ERK是MAPK三條主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，受上游特異性刺激分子MEK1/2雙磷酸化激活，活化后以二聚體形式存在，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，引起細(xì)胞增殖分化[19]。Xie等[20]的研究結(jié)果表明，mascRNA激活ERK/MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲表型。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ERK/MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白ERK和MEK，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，激活劑組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量升高。表明澳洲茄堿可抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活。

綜上所述，澳洲茄堿可抑制肝癌細(xì)胞增殖活性，降低惡性腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用，可為臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。