基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討補元湯干預(yù)慢性阻塞性肺疾病小氣道功能障礙的作用機制Δ

陳科勝，李少峰，昌 毅，危佳敏，魏 焜，蘭智慧(.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330000； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，南昌 330000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的特點為持續(xù)性氣流受限，臨床表現(xiàn)以氣喘、咳嗽、胸悶和呼吸困難為主[1]。研究結(jié)果表明，COPD發(fā)展的核心機制是炎癥，導(dǎo)致氣流受限的主要因素為小氣道病變[2]。小氣道病變出現(xiàn)于COPD的早期[3]。小氣道通常是指位于8級氣道以下至呼吸性細(xì)支氣管的內(nèi)徑<2 mm的氣道，且無軟骨支撐，因此容易發(fā)生塌陷[4]。小氣道表面積相當(dāng)于大氣道表面積的5 000倍，小氣道的氣道阻力占總阻力的比例<20%，容量占肺容量的98.8%[5]。隨著科學(xué)技術(shù)和臨床研究的不斷進(jìn)步，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小氣道功能障礙可伴隨COPD全程[6]。小氣道結(jié)構(gòu)和功能改變對COPD的控制和進(jìn)展有著持續(xù)且顯著的影響[7]。因此，尋找能有效、全面治療COPD小氣道功能障礙的方法，已成為COPD治療的迫切需要。

目前，西醫(yī)主要采用支氣管舒張劑、抗膽堿藥及糖皮質(zhì)激素等藥物治療COPD[8]。對于延緩疾病的發(fā)展、提高患者生活質(zhì)量，依然沒有有效的解決方法。究其原因，依靠當(dāng)前的吸入裝置，藥物難以到達(dá)小氣道位置。中醫(yī)辨證治療可減少COPD急性發(fā)作次數(shù)，緩解COPD患者氣促癥狀，提高生活質(zhì)量[9-10]。COPD在中醫(yī)學(xué)中被歸為“肺脹”“喘證”和“咳嗽”的范疇，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、胸悶和喘息等癥[11]。國醫(yī)大師洪廣祥教授認(rèn)為COPD發(fā)病的關(guān)鍵因素是宗氣虛，而COPD長期反復(fù)發(fā)作，必先傷于肺，致使肺氣虛損，繼而損及脾，使脾氣亦虛；肺脾氣虛愈重，則宗氣虛損愈甚；加以溫腎納氣之法，實現(xiàn)治療“動則喘甚”的臨床療效[12]。補元湯是洪廣祥教授治療COPD的經(jīng)驗方，在補中益氣湯基礎(chǔ)上加溫腎藥物而成，具體組方為黃芪、黨參、炙甘草、當(dāng)歸、陳皮、白術(shù)、山萸肉、升麻、鎖陽和柴胡，具有益氣溫陽、燥濕化痰、止咳平喘、化生宗氣、滋養(yǎng)元氣的作用[13]。臨床研究結(jié)果表明，補元湯能使COPD穩(wěn)定期患者小氣道功能、活動耐量、急性發(fā)作頻次和免疫能力得到有效改善[14]。但其具體的作用機制尚不明確。為了進(jìn)一步探究補元湯治療COPD小氣道功能障礙的作用機制，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接方法，搜集和分析藥物和疾病的相關(guān)信息，為COPD的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 補元湯活性成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http: //tcmspw.com/)[15]，收集生黃芪、黨參、柴胡、當(dāng)歸、升麻、陳皮、白術(shù)、山萸肉、鎖陽和甘草等10味藥物，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18收集補元湯的活性成分，運用Cytoscape 3.9.1軟件制作活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 補元湯活性成分靶點預(yù)測

在TCMSP獲取補元湯有效成分所對應(yīng)靶點的蛋白名，利用靶點的蛋白名在Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.Uniprot.org/)中進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，得到靶蛋白所對應(yīng)的基因名。并通過其插件CytoNCA進(jìn)行有效成分及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，參數(shù)值越大，說明該成分為補元湯的關(guān)鍵有效成分。

1.3 COPD相關(guān)靶點預(yù)測

以“Chronic Obstructive pulmonary Disease”為關(guān)鍵詞，使用Disgenet網(wǎng)站(http://www.disgenet. org/home)、GeneCards平臺(https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://www.omim.org/)，搜索COPD相關(guān)靶點及基因，將3個數(shù)據(jù)庫得到的COPD靶點及基因刪除重復(fù)值，最終得到COPD相關(guān)靶點。

1.4 補元湯治療COPD靶點預(yù)測

通過Venny 2.1.0在線工具繪制補元湯有效靶點與COPD相關(guān)靶點的韋恩圖并取交集，得到補元湯與COPD共同作用的靶點，即為補元湯治療COPD的潛在靶點。

1.5 構(gòu)建成分網(wǎng)絡(luò)圖

將補元湯中藥物的組成、有效成分以及相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中，繪制藥物-成分-靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 藥物成分與疾病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將補元湯和COPD的共同作用靶點導(dǎo)入STRING平臺(https://string-db.org/)，選定物種為“Homosapiens”，并設(shè)定靶點關(guān)聯(lián)的置信度為0.40，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并將下載的“tsv.”文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.1軟件實現(xiàn)可視化，并通過設(shè)置度值，得到核心靶點。

1.7 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將補元湯與COPD的交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺中進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，選定物種為智人“Homo Sapiens”，設(shè)置篩選條件為P<0.05，得到生物學(xué)過程富集和通路富集。挑選前20條生物過程、前18條分子功能、前9條細(xì)胞組成，以及前18條KEGG通路。

1.8 活性成分-靶點分子對接

借助PubChem平臺確定成分名稱、分子量和3D結(jié)構(gòu)，然后在RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫中下載活性成分所對應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)。然后利用AutoDock Vina軟件準(zhǔn)備分子對接所需的配體和蛋白質(zhì)，對于目標(biāo)蛋白，其晶體結(jié)構(gòu)需預(yù)處理，包括去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場參數(shù)，之后滿足配體結(jié)構(gòu)的低能量構(gòu)象。最后將靶點結(jié)構(gòu)與活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接，Pymol 3D結(jié)構(gòu)可視化。

2 結(jié)果

2.1 補元湯活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，通過OB、DL篩選出補元湯各藥物有效活性成分153個，其中黃芪17個，黨參17個，柴胡13個，陳皮5個，升麻8個，白術(shù)4個，山萸肉14個，當(dāng)歸2個，鎖陽9個，炙甘草87個，藥物共同活性成分12個，見表1。

表1 補元湯活性成分信息Tab 1 Active ingredients of Buyuan decoction

2.2 補元湯活性成分靶點預(yù)測

將TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取的補元湯相關(guān)靶點輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)值后共得到作用靶點284個。將上述藥物、成分及靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化。圖中用藍(lán)色圓形表示補元湯藥物，用橙色菱形、粉色菱形及綠色六邊形分別表示藥物有效成分、藥物共同成分及預(yù)測靶點，節(jié)點之間的邊表示藥物-成分-靶點之間的相互作用關(guān)系。將預(yù)測靶點按度值進(jìn)行分析，圖形越大，說明該靶點為重要靶點，其對應(yīng)的活性成分也越多，該成分越可能是核心活性成分，見圖1。利用CytoNCA插件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)得出前4位活性成分分別為槲皮素、山柰酚、豆甾醇和谷甾醇，見表2。

圖1 補元湯治療COPD藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of drug-ingredient-target of Buyuan decoction in the treatment of COPD

表2 補元湯治療COPD的主要活性成分Tab 2 Main active ingredients of Buyuan decoction in the treatment of COPD

2.3 COPD相關(guān)靶點預(yù)測

以“Chronic obstructive pulmonary disease”為檢索詞，通過Disgenet、OMIM和GeneCard等平臺搜索，最終在Disgenet中得到靶點588個，OMIM中得到靶點49個，GeneCards中得到靶點199個，對各基礎(chǔ)工具檢索的結(jié)果進(jìn)行合并，對相同靶點去重后共得到疾病靶點1 038個。

2.4 補元湯治療COPD靶點和PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Venny 2.1.0在線工具中導(dǎo)入補元湯的相關(guān)靶點和COPD的相關(guān)靶點取交集，共得到49個共同作用靶點，見圖2。將49個共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并下載“tsv.”文件通過Cytoscape進(jìn)行可視化，見圖3。尋找靶點與靶點間直接及間接作用關(guān)系。用圖形面積大小以及顏色深淺表示度值的大小，圖形面積越大，顏色越深，表明自由度值越高，其參與的生物功能也越豐富。圖3中有節(jié)點49個，邊1 116條，其中最小自由度30，最大自由度60，平均自由度45。再利用CytoNCA插件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，白細(xì)胞介素(IL)6、蛋白激酶B(Akt)1、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、腫瘤蛋白p53(TP53)和IL-1β等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)值，點度中心性、中介中心性和接近中心性最高，為補元湯治療COPD的主要靶點，見表3。

圖2 補元湯活性成分靶點與COPD治療相關(guān)靶點韋恩圖Fig 2 Venn diagram of targets of active components of Buyuan decoction and COPD treatment-related targets

圖3 補元湯治療COPD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of protein-protein interaction of Buyuan decoction in the treatment of COPD

表3 補元湯治療COPD的主要靶點(度值排序居前7位)Tab 3 Main targets of Buyuan decoction in the treatment of COPD (top 7 ranked by degree)

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

把補元湯作用于COPD的49個共同靶點導(dǎo)入Meascape數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)置物種為智人，P<0.05，其中GO得到分子功能(MF)414個；生物進(jìn)程(BP)3 879個；細(xì)胞組分(CC)297個；KEGG分析得到214條與COPD有關(guān)的通路。通過作圖工具R軟件繪制出補元湯治療COPD的KEGG分析氣泡圖以及補元湯治療COPD的GO分析條形圖，見圖4—5。從圖中可以得出，補元湯治療COPD的主要通路為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路。其中AGE-RAGE信號通路參與的基因包括Akt1、細(xì)胞周期蛋白D1、IL-1A、一氧化碳合酶3、糜蛋白酶；HIF-1信號通路參與的基因包括表皮生長因子受體、酪氨酸激酶受體、血紅素加氧酶1、IFNG、IL-6、VEGFA等。

圖4 補元湯作用靶點的KEGG分析圖Fig 4 KEGG analysis chart of targets of Buyuan decoction

圖5 補元湯作用靶點的GO分析圖Fig 5 GO analysis chart of targets of Buyuan decoction

2.6 分子對接驗證

將補元湯中的前3位有效成分與PPI中得到的前4位核心蛋白靶點進(jìn)行分子對接，受體蛋白IL-6、VEGFA、MMP9及TNF對應(yīng)的PDB-ID分別為1ALU、1MKK、6ESM及5UUI，其“Affinity ”(J/mol)值即代表兩者結(jié)合的結(jié)合能力，結(jié)合能力越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)固。分子對接結(jié)果見表4。山柰酚、槲皮素2種主要活性成分分子對接模式圖均有氫鍵作用，說明關(guān)鍵分子與靶點蛋白作用結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，見圖6。

表4 分子對接結(jié)合能Tab 4 Molecular docking-binding energy

A.槲皮素-MMP9；B.槲皮素-VEGFA；C.槲皮素-IL-6；D.山柰酚-TNFA. quercetin-MMP9; B. quercetin-VEGFA; C. quercetin-IL-6; D. kaempferol-TNF圖6 分子對接模式圖Fig 6 Diagram of molecular docking pattern

3 討論

氣流受限、氣道損傷和重塑、肺實質(zhì)破壞導(dǎo)致肺氣腫等是COPD的主要病理變化[16]。小氣道是COPD中氣流受限的主要部位，而小氣道周邊肺泡附著點喪失是影響氣流受限的主要決定因素[17]。此外，肺泡附著點的喪失與氣道壁中的中性粒細(xì)胞炎癥及氣道外來的膠原降解有關(guān)，也是COPD肺功能降低的主要因素[18]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，微生物和吸入顆粒侵犯小氣道時，將激活先天免疫信號傳導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)的中性粒細(xì)胞浸潤到小氣道壁[19]。中性粒細(xì)胞通過分泌絲氨酸蛋白酶破壞肺泡附著點[20]?？偠灾泻︻w粒的連續(xù)沉積會誘發(fā)慢性炎癥免疫細(xì)胞浸潤、組織修復(fù)和氣道重塑過程的循環(huán)，上述過程使得小氣道管腔橫截面積顯著降低，這些是導(dǎo)致氣道氣流受限的病理基礎(chǔ)[21]。

PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，補元湯治療COPD的主要靶點為IL-6、TNF、VEGFA、MMP9、Akt1、IL-1β和TP53等。IL-6由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，是一種可溶性介質(zhì)，具有多效性作用，主要體現(xiàn)在炎癥、免疫反應(yīng)和造血等方面，并長期參與炎癥刺激導(dǎo)致氣道阻塞、氣道及血管重塑[22]；TNF-α是TNF中調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵因子，也是嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)吸引劑，可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞積累、刺激炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激，血管生成和小氣道重塑[23]；MMP-9是MMP家族的重要成員，可重塑小氣道及降解肺泡壁基底膜，并激活和釋放VEGFA，誘導(dǎo)肺部血管新生與血管重塑[24]；Akt1為蘇氨酸蛋白激酶，通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化，使炎癥反應(yīng)加重及氣道呈纖維化改變，從而導(dǎo)致小氣道的固定性梗阻[25]；IL-1β為促炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程中起著核心作用，包括介導(dǎo)參與繼發(fā)性炎癥的大量基因的表達(dá)，協(xié)調(diào)局部炎癥的各方面，并在感染部位吸引和激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。

在KEGG通路富集分析中，AGE-RAGE信號傳導(dǎo)在COPD中是個信號級聯(lián)反應(yīng)，通過激活多種細(xì)胞內(nèi)途徑，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。AGE-RAGE信號傳導(dǎo)著不同的效應(yīng)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，AGE-RAGE信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、自噬、炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變等過程；在平滑肌細(xì)胞中，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生、增殖和鈣化[26]。HIF-1信號通路是細(xì)胞和機體在低氧適應(yīng)性反應(yīng)中至關(guān)重要的調(diào)控因子，由1個α亞基(氧不穩(wěn)定)和1個β亞基(氧穩(wěn)定)異源二聚構(gòu)成，HIF-1β表達(dá)不受氧氣影響，而HIF-1α是細(xì)胞對缺氧、氧化劑和炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑[27]。在肺組織缺氧情況下，刺激HIF-1α高度表達(dá)，并且激活相關(guān)能量代謝、糖類酵解和血管生成維持氧平衡。HIF-1α可作用于VEGF，提高血氧含量[28]。HIF-1α與VEGF關(guān)系密切，低氧條件下，HIF-1α可作用于靶基因VEGF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，上調(diào)下游的VEGF表達(dá)，提升血管通透性，出現(xiàn)血管滲出物和組織水腫等情況，易引發(fā)炎癥，加重肺的病變[29-30]。此外，HIF-1α還可上調(diào)VEGF表達(dá)使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，起著能讓缺氧細(xì)胞存活的作用[31]。上述通路可以通過調(diào)控炎癥因子釋放和抑制炎癥反應(yīng)等途徑，在炎癥反應(yīng)、血管生成等方面起著重要作用，達(dá)到治療COPD的效果。

山柰酚、槲皮素和谷甾醇等已被證明具有抗氧化、抗炎作用[32-34]。山柰酚是廣泛存在于多種植物中的多醇羥基黃酮類化合物[35]；其可降低促炎細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素、TNF和IL的產(chǎn)生，以及mRNA表達(dá)，發(fā)揮重要的抗炎作用[36]。槲皮素是類黃酮化合物，可以改善精神狀態(tài)，降低感染風(fēng)險[37]；其通過減少氧化應(yīng)激，肺部炎癥、彈性蛋白酶、MMP9和MMP12的表達(dá)，改善肺部的彈性，減輕氣道炎癥[38]；其還具有廣譜抗菌特性，對細(xì)菌和真菌有良好的抑制作用，其抗菌機制主要包括破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和改變細(xì)胞通透性，影響蛋白質(zhì)的合成和表達(dá)，降低酶活性，抑制核酸合成[38]。谷甾醇可通過增加抗菌肽表達(dá)、減少細(xì)菌結(jié)合位點結(jié)合等方式起到殺傷病原微生物的作用[39]；還可通過抑制P38絲裂原活化蛋白酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和核因子κB通路的活化來發(fā)揮抗炎作用。豆甾醇是一種具有藥理學(xué)性質(zhì)的植物甾醇，可通過抑制促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，起到抗炎作用[40]。上述3類有效成分都具有抗炎、抗氧化的作用，可減輕小氣道炎癥，有益于預(yù)防或減緩COPD中小氣道疾病的進(jìn)展，可有效改善小氣道功能，有望成為治療COPD小氣道功能障礙的新型藥物。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)，得出補元湯能夠多成分、多靶點、多通路治療COPD，其活性成分山柰酚、槲皮素和谷甾醇等作用于IL-6、TNF、VEGFA、MMP9、Akt1、IL-1β和TP53等靶點，通過AGE-RAGE信號通路和HIF-1信號通路，抑制細(xì)胞因子釋放，減輕小氣道過度免疫反應(yīng)并消除炎癥；防止小氣道周圍肺泡附著點被破壞，并促進(jìn)血管生成，進(jìn)而改善小氣道功能，達(dá)到治療COPD的效果，從而有效改善COPD患者的肺功能、活動耐量。