納米抗體在食品小分子污染物檢測中的研究應(yīng)用

金 萍 丁洪流 金曉紅 沈麒亮 范春燕

(1. 蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 蘇州 215128；2. 蘇州市食品檢驗檢測中心，江蘇 蘇州 215128)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是中國食品安全快速檢測中應(yīng)用的主要方法，對其研究主要集中于真菌毒素[1-2]、農(nóng)獸藥殘留[3-6]、食品污染物等[7-10]方面。這類產(chǎn)品多數(shù)可以在30 min內(nèi)完成定量或半定量檢測。免疫檢測研究主要是基于單克隆抗體，但小分子的單克隆抗體制備難度大，假陽性和假陰性率高，價格昂貴，不易保藏。因此，各種類型小分子功能抗體的開發(fā)是目前免疫分析研究的重點，其中納米抗體(Nanobody，Nb)具有相對分子量低、對熱以及化學(xué)試劑等有較高的耐受能力和易表達改造等優(yōu)勢[11]。研究擬對納米抗體的特性及其在小分子污染物檢測方面的應(yīng)用進行綜述，展望納米抗體在生物檢測技術(shù)及診斷研究中的發(fā)展。

1 納米抗體的結(jié)構(gòu)及其特性

Nb較傳統(tǒng)抗體發(fā)現(xiàn)較晚，感染或者免疫過的單峰駱駝的免疫反應(yīng)會產(chǎn)生普通的抗體IgG及僅有重鏈的抗體(HcAb)，這兩種類型的抗體均有與抗原結(jié)合的能力。HcAb只包含一個重鏈可變區(qū)(VHH)以及CH2、CH3兩個常規(guī)區(qū)，其分子量約為90 kDa，比傳統(tǒng)IgG的150 kDa小得多。VHH的分子量只有15 kDa，因此也被稱作Nb。VHH易于進行基因操作獲得較多的單價、雙價和多價Nb，比傳統(tǒng)抗體具有更廣泛的用途[12-15]。目前發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生Nb的免疫動物除單峰駱駝外，還有羊駝及鯊魚等。目前，被用作Nb制備的最常用免疫動物為羊駝[16-17]。Nb除具有與原IgG抗體相當?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性外，還具有多項更優(yōu)良的特點，Nb幾乎完全克服了傳統(tǒng)抗體研發(fā)周期長、穩(wěn)定性差、保存條件嚴格等缺陷；與人工改造的單鏈抗體片段(scFv)不同，Nb不容易相互黏附聚合成塊，逐漸成為診斷試劑中的新興力量[18-19]，更具研究和應(yīng)用價值。各抗體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 抗體結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Diagram antibody structure

1.1 分子小、親和力強、水溶性好

Nb分子較很小，其產(chǎn)生的空間位阻小，有利于結(jié)合一些隱蔽位點[20]。

Nb具有較強的親和力與其結(jié)構(gòu)域直接相關(guān)，如圖2所示，VHH的空間結(jié)構(gòu)與常規(guī)抗體重鏈可變區(qū)(VH)相似，由9個反向平行的β折疊片層通過鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起。Nb存在3個互補決定區(qū)(CDR)，相較于VH較長，編號為CDR1、CDR2、CDR3，形成凸起結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為其抗原結(jié)合位點。這3個CDR區(qū)域被4個序列相對保守的骨架區(qū)(FR)分隔開，編號為FR1、FR2、FR3、FR4[21]。相比于人和小鼠VH中CDR3區(qū)9～12個氨基酸[22]，VHH的CDR3區(qū)明顯更長，單峰駱駝VHH中CDR3的平均長度約為17個氨基酸，大羊駝為15個氨基酸，甚至有超過25個氨基酸長度的[23-24]。Nb較長的CDR3區(qū)域可以形成凸起的環(huán)形區(qū)域，潛在地增加了互補位構(gòu)象的多樣性，彌補了CDR區(qū)數(shù)量較少所引起的抗原結(jié)合力不足的缺陷[25]。

圖2 VH和VHH多肽結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 Schematic diagram of VH and VHH polypeptide structure

Nb的序列雖與常規(guī)抗體相似，但其具有更好的親水性，原因在于個別位點的差異，VH中多為疏水的氨基酸，但在VHH中變成了親水的氨基酸，使得納米抗體擁有更好的可溶性[26]，具有更好的組織滲透力，能夠進入腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮作用，甚至還可以有效地穿透血腦屏障。

1.2 高熱抗性

常規(guī)IgG抗體對高溫耐受性差，容易發(fā)生不可逆的熱聚合而失活，對保存環(huán)境要求較高。相較于常規(guī)IgG抗體，Nb大多具有很強的熱抗性，在加熱后能夠重新折疊，仍保存相當?shù)目贵w活性，利于長期保存[27]。Liu等[28]在開發(fā)赭曲霉毒素A (OTA)的Nb-ELISA方法時，對OTA的納米抗體(Nb15、Nb28、Nb32、Nb36)與OTA的特異性單克隆抗體6H8進行了熱穩(wěn)定性比較，發(fā)現(xiàn)OTA的納米抗體在95 ℃暴露5 min或90 ℃暴露75 min后仍能保持抗原結(jié)合活性。Bever等[29]在采用羊駝VHH抗體進行2,2′,4,4′ -四溴二苯醚檢測的開發(fā)與利用中發(fā)現(xiàn)，高溫條件(95 ℃，10 min)下，羊駝VHH抗體仍保留了>50%的抗體結(jié)合活性，而相對應(yīng)的多克隆抗體活性喪失。

Nb的穩(wěn)定性與其內(nèi)部存在的二硫鍵關(guān)系密切，F(xiàn)R1和FR3之間存在保守二硫鍵，部分在CDR3和CDR1、CDR3和CDR2之間還有額外二硫鍵[21]，保守二硫鍵以及額外二硫建的存在增加了CDR3區(qū)凸形結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Akazawa-Ogawa等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Nb的耐熱性隨二硫鍵數(shù)量的增加而降低。Hagihara等[31]研究表明二硫鍵是一種穩(wěn)定抗體片段的方法，可通過約束蛋白質(zhì)的未折疊結(jié)構(gòu)，從而提高折疊結(jié)構(gòu)域的機械穩(wěn)定性和構(gòu)象穩(wěn)定性。

Linden等[32]將抗原特異性的羊駝VHH抗體片段與抗原特異性的小鼠單克隆抗體在特異性、親和力和穩(wěn)定性方面進行比較發(fā)現(xiàn)，相對于抗原特異性的小鼠單克隆抗體，抗原特異性的羊駝VHH片段具有極強的溫度穩(wěn)定性。1/3的大羊駝VHHs能夠在高達90 ℃的溫度下特異性結(jié)合抗原，而全部的小鼠單克隆抗體在該溫度下不起作用。

1.3 化學(xué)耐受性

甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亞砜等化學(xué)試劑是樣品提取中的常用試劑，但常規(guī)IgG抗體化學(xué)耐受性較差，提取液中化學(xué)試劑的殘留會影響后期抗體結(jié)合能力，因此，篩選出高化學(xué)耐受性的抗體可以簡化前處理過程，減少目標物的損耗，增強檢測靈敏度。

He等[33]對黃曲霉毒素B1(AFB1)納米抗體與特異性單克隆抗體在有機溶劑和高溫下的穩(wěn)定性進行比較，發(fā)現(xiàn)Nb對甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亞砜等有機溶劑耐受性較好，并且基于Nb對甲醇的高耐受性，樣品提取物采用不稀釋的納米ELISA分析，靈敏度得到了提高。Zhang等[34]在建立對硫磷VHH-堿性磷酸酶一步法dc-FEIA時發(fā)現(xiàn)，對硫磷Nb在40%的甲醇、乙腈以及二甲基亞砜中可保留50%的活性。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)克百威Nb對甲醇以及乙腈耐受性較好，可耐受50%的甲醇和30%的乙腈。

1.4 低免疫原性

在基因序列層面，駱駝的VHH序列與人VH3序列同源度高[36]，加之Nb的分子量較小，對人體造成的免疫原性較弱。另一方面，Nb沒有傳統(tǒng)IgG抗體的Fc段，可以避免Fc段引起的補體反應(yīng)[37]。

2 Nb在小分子污染物檢測中的應(yīng)用

小分子化合物(<1 000 Da)免疫檢測研究中，先需要與大分子蛋白等載體交聯(lián)形成完全抗原，再免疫機體制備多克隆抗體和單克隆抗體。這類傳統(tǒng)抗體分析性能雖然表現(xiàn)優(yōu)異，但對溫度或有機溶劑等穩(wěn)定性欠佳，而Nb在溫度耐受性以及化學(xué)耐受性方面都具有更明顯的優(yōu)勢。因此，Nb在小分子免疫檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究雖起步較晚，但近些年報道逐漸增多，在真菌毒素、農(nóng)獸藥殘留以及小分子有毒污染物等檢測中多有研究。

2.1 真菌毒素的免疫檢測

受真菌毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品和食品會對人類和動物健康造成嚴重危害，甚至導(dǎo)致死亡。黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)等都屬于真菌毒素?；趩慰寺】贵w或者多克隆抗體建立的免疫檢測方法在真菌毒素檢測中展現(xiàn)了優(yōu)良的靈敏度、精確性，同時兼具使用方便的優(yōu)勢，但傳統(tǒng)抗體的局限限制了其進一步的發(fā)展，因此，近些年，對Nb在真菌毒素檢測領(lǐng)域進行了大量研究[38-40]。

季艷偉[41]針對赭曲霉毒素A(OTA)，采用從羊駝天然納米抗體文庫中篩選獲得的OTA抗獨特型Nb，以其作為OTA模擬抗原，建立了ELISA方法；與化學(xué)合成抗原所建立的方法進行比較，靈敏度較以往提高了10倍。吳慧[42]以玉米赤霉稀酮(ZEN)為研究對象，建立了基于噬菌體展示Nb的ELISA檢測方法。通過對試驗中各參數(shù)的優(yōu)化，ZEN的添加回收率可以達到71.7%～102.2%。司睿等[43]從抗微囊藻毒素(MC-LR)噬菌體展示Nb文庫中篩選，獲得編號M110的Nb，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建了水體中MC-LR檢測的間接競爭ELISA，并進行了方法間驗證，與超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法的相關(guān)系數(shù)達0.998。曹冬梅等[44]利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了編號G8DE 抗AFB1納米抗體，將G8的基因與堿性磷酸酶(AP)基因融合，基于Nb-AP融合蛋白構(gòu)建了一步式ELISA方法，經(jīng)測定檢出限為2.6 ng/mL。

2.2 農(nóng)獸藥殘留的免疫檢測

近年來，由于農(nóng)獸藥工業(yè)的快速發(fā)展和養(yǎng)殖過程中抗藥性的產(chǎn)生，農(nóng)獸藥用量逐年攀升，農(nóng)獸藥殘留超標成為食品安全的“頑疾”。Liu等[45]基于羊駝免疫獲得的VHH C1和包被抗原CBR2-BSA，建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗，用于谷物中西維因的檢測?；赩HH的酶聯(lián)免疫吸附試驗對谷物樣品中西維因進行了簡單提取和稀釋，具有良好的檢測效果。Zhang等[35]通過噬菌體展示技術(shù)分離并獲得了抗呋喃丹納米抗體，建立了一種間接競爭ELISA，可用于檢測果蔬樣品中的呋喃丹殘留。結(jié)果顯示，采用簡單的樣品前處理程序，省去了有機溶劑的蒸發(fā)等環(huán)節(jié)，可以獲得與超高效液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法一致的結(jié)果。Zhang等[34]構(gòu)建了VHH9-堿性磷酸酶融合物(VHH-AP)，并用于建立1/2最大抑制濃度的一步一步直接競爭熒光酶免疫分析(dc-FEIA)，通過對大白菜、黃瓜和生菜樣品的加標驗證以及UPLC-MS/MS的結(jié)果確認。結(jié)果表明，基于VHH-AP的dc-FEIA是可重復(fù)檢測蔬菜樣品中對硫磷殘留的檢測方法。高海崗等[46]從羊駝免疫庫篩選、運用噬菌體展示技術(shù)獲得抗孔雀石綠(MG)納米抗體，基于該抗體建立了孔雀石綠膠體金免疫層析檢測試紙條，檢測結(jié)果與國標方法一致。

2.3 小分子有毒物質(zhì)的免疫檢測

Wang等[47]利用駝峰單結(jié)構(gòu)域抗體—堿性磷酸酶融合蛋白(T3-15-AP)一步免疫法測定四溴雙酚A(TBBPA)，環(huán)境溫度下，以T3-15-AP為基礎(chǔ)的試驗至少70 d內(nèi)可觀察到更高的結(jié)合穩(wěn)定性。Fu等[48]將駱駝脂提取的TBBPA特異性納米體與堿性磷酸酶融合獲得雙功能融合蛋白，使TBBPA特異性結(jié)合的同時產(chǎn)生檢測信號，建立了一種熒光酶聯(lián)免疫吸附法(FELISA)。經(jīng)驗證，該方法與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)結(jié)果具有良好的相關(guān)性，可作為監(jiān)測TBBPA暴露量的有效方法。姜忍忍[49]利用噬菌體—納米抗體展示技術(shù)成功獲得了針對重金屬鎘(Cd)的特異性納米抗體，并初步建立了間接競爭性ELISA免疫檢測法，成功用于水樣重金屬鎘離子的檢測。俞華齊[50]通過篩選納米抗體庫成功獲得了噬菌體抗體Cr-DTPA-VHH4-63，圍繞該納米抗體，建立了檢測重金屬鉻(Cr)的間接競爭性ELISA檢測法。

3 結(jié)語

傳統(tǒng)較成熟的食品小分子污染物檢測產(chǎn)品主要有免疫膠體金試紙條以及免疫試劑盒等，產(chǎn)品多采用傳統(tǒng)IgG抗體，此類抗體熱穩(wěn)定性較差，要求絕對的冷鏈運輸和貯藏，同時使用周期較短，使用時友好度欠佳。納米抗體作為新型抗體，與傳統(tǒng)的IgG抗體相比，具有更好的特性：納米抗體有更高的熱穩(wěn)定性，可以大大延長抗體的使用壽命；納米抗體具有更高的化學(xué)耐受性，可以減少前處理中有機溶劑對其的限制；納米抗體方便進行基因操作，或者加入各種標簽以方便各種檢測應(yīng)用，這將有望解決免疫檢測中的一大瓶頸——多重檢測?；诩{米抗體的諸多優(yōu)點，在小分子物質(zhì)免疫檢測領(lǐng)域正慢慢替代傳統(tǒng)抗體。