珍珠貝水解肽的制備、氨基酸組成及抗炎活性

沈金鵬 王珂雯 黃潘鈿 陳冰冰 夏 珍 李應坤 王湘華 曹 庸 苗建銀 林碧敏

(1. 華南農業(yè)大學食品學院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 北海黑珍珠海洋生物科技有限公司，廣西 北海 536000；3. 華南農業(yè)大學基礎實驗與實踐訓練中心，廣東 廣州 510642)

炎癥是機體免疫系統對創(chuàng)傷、微生物病原體感染或化學刺激引起的組織損傷和感染而做出的一種保護性生理防御機制[1]。巨噬細胞是動物機體內最重要的免疫細胞，也是機體防御反應的重要組成部分，當機體受到外界因素刺激時，活化的巨噬細胞能通過MAPK和NF-κB等通路釋放多種炎癥細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用，包括促炎介質，如一氧化氮(NO)以及促炎細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[2]，這些炎癥因子在誘發(fā)多種炎癥性疾病的過程中發(fā)揮著關鍵作用。炎癥免疫反應的失調會導致促炎介質和細胞因子的過度積累，可能誘發(fā)機體功能性障礙以及多種急性、慢性疾病，如動脈粥樣硬化、癌癥、類風濕性關節(jié)炎、急性腸胃炎和過敏等。因此，抑制活化巨噬細胞中的促炎介質和細胞因子有助于炎癥性疾病的治療[3-4]。近年來，抑制炎癥細胞因子的合成或活性已成為炎癥治療的主流，促炎細胞因子抑制劑可作為抗炎藥的候選藥物[5]。最常用的治療藥物是類固醇、非類固醇抗炎藥和單克隆抗體[6]，但其中許多藥物都伴有不良副作用，如降低組織的可修復性和損傷胃腸黏膜，且炎癥相關疾病發(fā)病率的增加促使人們尋找具有抗炎特性的天然化合物。在炎癥反應中發(fā)現的幾種內源性多肽，如血管活性腸肽(VIP)、α-促黑素細胞激素(αMSH)和腎上腺髓質素等已成為抗炎劑，可用于炎癥和自身免疫疾病的新療法[5，7-8]，且?guī)追N合成肽和天然肽，如鱘魚肉水解肽[9]、牡蠣水解肽[10]、雞肉蛋白水解肽[11]等已被證實可通過抑制炎癥細胞因子的產生或表達信號轉導途徑，來防止過度的炎癥反應。

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)又稱合浦珠母貝，是中國沿海地區(qū)珍珠養(yǎng)殖的主要品種之一[12]。馬氏珠母貝肉營養(yǎng)成分豐富，富含多種功效氨基酸和活性肽，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞等藥理作用[13]。然而取珠后的新鮮貝肉僅作為動物飼料，原料附加值較低，有待深入研究和高值化開發(fā)利用[14]。

研究利用蛋白酶對馬氏珠母貝肉進行酶解，探究酶解制備活性肽的最優(yōu)工藝參數和條件，并利用小鼠巨噬細胞RAW264.7抗炎評價模型對珍珠貝水解肽進行活性評價，以期為馬氏珠母貝肉生物活性成分的高值化利用提供理論依據，為馬氏珠母貝肉抗炎活性肽的開發(fā)提供技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝肉：北海黑珍珠海洋生物科技有限公司；

中性蛋白酶(10 萬U/g)、胰蛋白酶(25萬 U/g)、堿性蛋白酶(20萬 U/g)和木瓜蛋白酶(20萬 U/g)：食品級，南寧龐博生物工程有限公司；

三硝基苯磺酸(TNBS)：分析純，成都化夏化學試劑有限公司；

噻唑藍(MTT)：分析純，上海麥克林生物化學公司；

脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)：生化試劑，美國Sigma公司；

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)：生化試劑，賽默飛世爾科技公司；

小鼠巨噬細胞RAW264.7：中科院上海細胞所；

其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市華城海龍實驗儀器廠；

多管架自動平衡離心機：L530型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

電子天平：AL104型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：PHS-3CW型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

多功能酶標儀：Enspire2300型，美國PerkinElmer公司；

微量振蕩器：MH-2型，海門其林貝爾儀器制造有限公司；

真空冷凍干燥機：FD-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

全自動氨基酸分析儀：S-433D型，賽卡姆(北京)科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬氏珠母貝肉酶解物的制備 馬氏珠母貝肉洗凈瀝干，打碎成貝肉勻漿，置于-20 ℃冷凍保存。試驗時解凍，稱取一定量貝肉勻漿，按料液比1∶1 (g/mL)加入一級水，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)溶液pH值至最適pH值，按酶底比0.3%加入蛋白酶，在恒溫水浴鍋中酶解3 h，酶解過程中每30 min攪拌混勻酶解液，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。將上清液置于-20 ℃凍結后，進行冷凍干燥，得到珍珠貝水解肽凍干粉，于-20 ℃凍藏備用。

1.3.2 酶解工藝優(yōu)化

(1) 最適酶的篩選：各蛋白酶最適條件見表1，在各種蛋白酶最適條件下按1.3.1進行酶解。

表1 4種蛋白酶的最適酶解條件

(2) 單因素試驗：選擇水解度最高的一種蛋白酶對影響水解度的4個因素(酶解溫度、酶解時間、酶底比和料液比)進行優(yōu)化，以水解度為評價指標，初始條件選取：酶底比0.3%、料液比1∶3 (g/mL)、酶解溫度45 ℃和酶解時間3 h。主要優(yōu)化條件：酶底比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)，料液比[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]，酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)，酶解時間(1，2，3，4，5 h)，各組試驗均重復3次，數據取平均值。

(3) 響應面法優(yōu)化酶解工藝：根據單因素試驗結果，使用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面分析，以水解度指標為響應值進行Box-Behnken設計，建立三因素三水平的響應面分析試驗，對顯著性影響因素進行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)酶解工藝條件。

(4) 水解度的測定：采用TNBS法測定蛋白質水解度。根據Adler-Nissen等[15-16]的方法，略作修改。以L-亮氨酸作標準品繪制標準曲線。取酶解上清液0.125 mL，加入1 mL pH 8.2，0.2 mol/L PBS和1 mL 0.1% TNBS，50 ℃恒溫避光反應1 h，冷卻至室溫后加入2 mL 0.1 mol/L HCl并振蕩使反應完全終止，340 nm下測定吸光值。按式(1)計算水解度[17]。

(1)

式中：

K——水解度，%；

y——亮氨酸濃度，mmol/L；

B——樣品在340 nm下的吸光值；

A——去離子水在340 nm下的吸光值；

m——酶解樣品的質量，g；

P——酶解樣品中的蛋白質含量，g/g；

Htot——蛋白質總肽鍵數，7.85 mmol/g蛋白質。

1.3.3 蛋白質含量測定 按GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法執(zhí)行。

1.3.4 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動分析儀。

1.3.5 抗炎活性評價

(1) 細胞培養(yǎng)：小鼠巨噬細胞RAW264.7用含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數生長期進行傳代。當細胞鋪板率大于培養(yǎng)瓶面積的80%時，吸盡原培養(yǎng)基，3 mL PBS緩沖液洗滌細胞兩次，移液槍吸取培養(yǎng)液2 mL 吹打細胞至完全脫落，細胞計數，根據計數結果調整細胞懸液濃度，接種至孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對細胞設計試驗分組：空白組以完全培養(yǎng)基孵育；模型組以1 μg/mL的LPS孵育；試驗組以不同濃度的待測樣品加LPS(1 μg/mL)。每組設置3個復孔。

(2) MTT法測定細胞存活率：采用MTT法評估樣品對細胞的毒性作用。調整細胞濃度至1×104個/mL，按每孔100 μL將細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后吸盡原培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞兩次，試驗組分別加入含不同質量濃度的珍珠貝水解肽的完全培養(yǎng)基(0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL) 100 μL，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基，每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)并在培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT溶液后用PBS洗凈，每孔加入150 μL的DMSO完全溶解固體物質，震蕩10 min使結晶充分溶解，使用酶標儀測定490 nm下每孔的吸光值(A)，按式(2)計算細胞存活率。

(2)

式中：

S——細胞存活率，%；

A0——空白組吸光值；

A1——試驗組吸光值；

A2——模型組吸光值。

(3) NO濃度測定：采用Griess法對RAW264.7細胞的NO釋放量水平進行測定。調整RAW264.7細胞濃度為1×105個/mL，每孔500 μL接種至24孔板，置于培養(yǎng)箱孵育過夜，吸盡原培養(yǎng)基，空白組和模型組加入500 μL完全培養(yǎng)基，試驗組加入500 μL含不同濃度的珍珠貝水解肽的完全培養(yǎng)基(0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 mg/mL)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，吸盡原培養(yǎng)基并用PBS洗滌兩次，模型組和試驗組每孔加入500 μL 1 μg/mL的LPS溶液，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，在96孔板按50 μL/孔中加入樣品上清液，各孔中分別加入50 μL Griess Reagent Ⅰ試劑和Griess Reagent Ⅱ試劑，震蕩混合均勻，于450 nm測定吸光值。

(4) ELISA法測定細胞因子含量：按照ELISA測定試劑盒說明書操作，測定細胞培養(yǎng)上清液中的各細胞因子含量。酶標板上加入100 μL培養(yǎng)上清液，貼上封板膜后在37 ℃下避光孵育90 min，棄去液體，加入350 μL洗滌液，靜止30 s后棄去，在吸水紙上拍干，重復5次。加入100 μL生物素抗體工作液，貼上封板膜后37 ℃避光孵育1 h，洗板5次。加入100 μL酶結合物工作液，貼上封板膜后37 ℃避光孵育30 min，洗板5次。加入100 μL顯色液，37 ℃避光孵育15 min后，加入100 μL反應終止液，450 nm處測定吸光值。根據濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程，計算樣品中各細胞因子含量。

1.4 數據分析

各試驗進行3次平行，數據取平均值。統計分析采用SPSS 20.0軟件(IBM SPSS, USA)進行單因素方差 (ANOVA)和Duncan法分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可以看出，4種蛋白酶對貝肉的水解程度略有差異。由于酶的專一性，每種酶的酶切位點特定，酶解同一原料所得到的多肽，在肽序列、空間結構和分子量大小等方面具有很大差異，導致水解度也不同[18]。中性蛋白酶對馬氏珠母貝肉水解程度最高，為13.09%，故選擇中性蛋白酶為最適蛋白酶。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶底比對蛋白水解度的影響 由圖2可以看出，隨著酶底比增大，水解度呈先增加后降低的趨勢，該結果與馬駿等[19]在制備啤酒抗氧化肽時的酶解效果相似，出現這種趨勢可能是由于酶底比小，底物與蛋白酶不能充分結合，導致反應速度慢；隨著酶底比增大，底物與酶的接觸率增加，反應速度隨之加快；但當酶與底物結合位點趨于飽和后，過多的酶反而會出現競爭性抑制或酶自身相互水解，導致酶活力降低，影響體系反應速度，水解度下降[20]。當酶底比為0.3%時，水解度最高為13.58%，因此最適酶底比為0.3%。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 酶解溫度對水解度的影響 由圖3可以看出，隨著溫度的增加，水解度呈先增加后逐漸下降的趨勢，當酶解溫度為45 ℃時，水解度達到最大值為13.48%，酶解溫度達到45 ℃后水解度呈逐漸降低的趨勢。這是由于中性蛋白酶有其合適的反應溫度范圍，溫度過高可能會影響酶的穩(wěn)定性，破壞酶的特定空間結構，導致酶活性降低，酶解速度下降，進而使水解程度下降[21]。因此，選擇45 ℃ 作為最適的酶解溫度。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 料液比對水解度的影響 由圖4可以看出，水解度因料液比的不同而差異明顯。水解度與料液比呈負相關，料液比的提高會使水解度不斷下降，由于料液比增大時，酶濃度被稀釋，單位體積內酶含量降低，底物與酶的結合位點變少，使酶解效果受抑制[22]，同時隨著料液比的提高，單位體積內酶解出來的多肽濃度降低，從而導致水解度下降。當料液比為1∶1 (g/mL)時，水解度最高，為16.15%。因此，選擇1∶1 (g/mL)為最適料液比。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 酶解時間對水解度的影響 由圖5可以看出，水解度隨著酶解時間的延長呈先增加后逐漸平緩的趨勢，與劉東偉等[23]和張維等[24]的研究結果一致，酶解時間在1～2 h時對水解度的影響較為顯著，之后保持穩(wěn)定。這是因為酶解前期隨著酶解時間的增加，酶更容易與底物接觸，水解度快速增長，一定時間后，隨著底物濃度的降低，可水解的特定部位也隨之減少，水解度的增幅也隨之降低[25]。因此，選擇2 h為最適酶解時間。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應面試驗

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗 在單因素試驗結果的基礎上，選取酶底比、酶解溫度、酶解時間進行三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。響應面試驗設計見表2。以水解度為響應值，酶底比、酶解溫度、酶解時間為自變量，分析馬氏珠母貝肉酶解的最優(yōu)工藝指標。試驗結果見表3。

表2 響應面試驗設計

表3 響應面試驗結果

對表3數據進行回歸擬合，從而得到3個因素的二次多項回歸模型為：

Y=21.36+1.06A+0.72B-0.60C-0.53AB+0.61AC-0.62BC-1.98A2-2.02B2-0.55C2。

(3)

為檢驗該回歸方程的有效性，對其進行顯著性分析，結果見表4。

表4 回歸模型及方差分析?

由表4可知，回歸模型P<0.05，說明試驗數據與模型相符；失擬項對應的P=0.293 3>0.05，表明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，方程可行。通過對回歸方程的顯著性分析可以看出，A對響應值影響顯著(P<0.05)，A2和B2對響應值的影響極顯著(P<0.01)，由此可知試驗因子對響應值不是簡單的線性關系，并且酶底比對水解度有極顯著影響。

2.3.2 響應面交互作用分析 從圖6可以看出，酶底比和酶解溫度曲面坡度較大，酶解溫度在40～46 ℃時及酶底比在0.2%～0.3%時坡度更陡，之后趨于平緩，說明酶解溫度的二次項和酶底比的二次項對水解度的影響顯著。酶解時間和酶底比、酶解時間和酶解溫度曲面均有一定的坡度，但酶解時間曲面坡度趨于平緩，說明酶底比和酶解溫度對水解度的影響較大，酶解時間對水解度的影響較小。

圖6 各因素之間交互作用的響應曲面圖Figure 6 Response surface diagrams for interaction of various factors

2.3.3 驗證實驗 經Design-Expert V8.06軟件分析得到的最佳酶解條件為酶底比0.32%、酶解時間1.38 h、酶解溫度46.27 ℃，在此條件下，水解度預測值為21.71%。為了驗證響應面法的可行性，采用得到的最優(yōu)酶解條件進行驗證實驗，同時考慮到實際因素，修正工藝參數為：酶底比0.32%、酶解時間1.4 h、酶解溫度46.3 ℃，進行3次重復實驗得到的水解度為(22.88±0.90)%，與預測值無顯著性差異。因此，通過響應面法優(yōu)化提取珍珠貝水解肽的酶解條件是可行的，回歸模型較可靠。

2.4 氨基酸組成分析

如表5所示，酶解物中氨基酸種類齊全，必需氨基酸(EAA)含量為19.84%。活性肽的功能活性與其特殊的氨基酸以及排列順序有關，具有抗炎活性的肽富含疏水性和帶正電的氨基酸，尤其是在N端或C端，其中疏水性高的氨基酸可促進多肽與細胞膜之間的相互作用，并起到調節(jié)信號通路的作用，使多肽更容易進入靶細胞發(fā)揮抗炎細胞活性，帶正電荷的氨基酸也與抗炎活性有關[26]。在珍珠貝水解肽中，有助提高抗炎能力的氨基酸包括疏水性氨基酸(21.19%)和帶正電荷氨基酸(10.45%)，占比34.65%，從物質基礎層面表明珍珠貝水解肽可能具有抗炎方面的潛力。

表5 氨基酸組成分析?

2.5 珍珠貝水解肽抗炎活性

2.5.1 對小鼠巨噬細胞的毒性 如圖7所示，在0.125～4.0 mg/mL 的質量濃度范圍內各樣品均對RAW264.7細胞無細胞毒性，且在0.125～2.0 mg/mL濃度范圍內對細胞生長有促進作用。

2.5.2 對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的影響 如圖8所示，與空白組(C-)比較，LPS模型組(C+)的NO分泌顯著升高，表明抗炎細胞模型造模成功。與LPS模型組(C+)相比，添加不同質量濃度珍珠貝水解肽處理組均能顯著降低造模細胞上清液中NO含量，且呈濃度依賴性，其中最高質量濃度(2.0 mg/mL)處理組NO抑制率達70.00%。由此表明，珍珠貝水解肽可以有效降低炎癥細胞模型中的NO分泌，表現出顯著的抗炎活性。

2.5.3 對小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥因子分泌的影響

炎癥細胞因子是炎癥反應的關鍵因素。當病原體感染機體時，巨噬細胞可以通過產生細胞因子來抵抗病原體的入侵。在某種程度上，細胞免疫因子的水平可用于評估免疫反應[27]。

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如圖9所示，與空白組(C-)相比，使用LPS誘導后的模型組(C+)細胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌顯著上升，而使用不同多肽濃度處理組(0.125～2.0 mg/mL)干預的巨噬細胞產生的細胞炎癥因子分泌均被有效抑制，且均呈濃度依賴性，與NO釋放量的結果趨勢一致。其中最高質量濃度(2.0 mg/mL)處理組能夠顯著抑制RAW264.7巨噬細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的釋放，抑制率分別為83.01%，85.04%，80.43%，由此表明，珍珠貝水解肽能有效降低由LPS刺激的RAW264.7細胞炎癥因子的分泌。

3 結論

以馬氏珠母貝肉為原料，以水解度為指標篩選出中性蛋白酶為最佳用酶；基于單因素結果結合響應面優(yōu)化確定了最優(yōu)工藝參數：酶解時間1.4 h，酶底比0.3%，酶解溫度46.3 ℃。在此基礎上得到的酶解物氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸含量為19.84%，有助于提高抗炎活性的氨基酸(疏水性氨基酸和帶正電荷氨基酸)占比達31.65%。通過對珍珠貝水解肽的體外細胞炎癥評價模型發(fā)現，珍珠貝水解肽能夠有效降低由LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的NO和細胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量，表明珍珠貝水解肽具有良好的抗炎活性。后續(xù)將對珍珠貝抗炎肽的活性成分及其抗炎機制進行深入研究。

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