基于熒光法生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價及方法研究

潘一廷，張國城，霍勝偉，田 瑩，劉佳琪，楊振琪，商宇揚

(北京市計量檢測科學研究院 國家生態(tài)環(huán)境監(jiān)測治理產品質量監(jiān)督檢驗中心，北京 100029)

1 引 言

隨著我國經濟社會的發(fā)展，生物氣溶膠顆粒物污染防控對維護民生健康的重要性日益凸顯。有研究表明新冠病毒存在氣溶膠傳播擴散風險[1～5]，其可在空氣動力學直徑約1～3 μm的氣溶膠中保持傳染性和完整性達16 h[6～8]，因此生物氣溶膠引發(fā)的健康風險問題已引起廣泛關注。生物氣溶膠監(jiān)測儀是一類能實現(xiàn)快速、實時監(jiān)測生物氣溶膠的新興儀器[9～11]。其原理是利用光散射技術和熒光光譜技術相結合，實現(xiàn)對環(huán)境中發(fā)射特征波長的生物粒子進行監(jiān)測。近些年，國內外已有大量關于生物氣溶膠監(jiān)測儀的相關研究，尤其是半導體激光誘導熒光技術在生物氣溶膠監(jiān)測儀上的應用[12～14]，為實時、便捷、快速地監(jiān)測生物氣溶膠提供了發(fā)展空間。基于熒光法生物氣溶膠監(jiān)測儀市場需求的爆發(fā)式增長，生物氣溶膠監(jiān)測儀性能評價研究成為了急需解決的問題。

目前，生物氣溶膠監(jiān)測評價方法基本是通過細菌產生生物氣溶膠后，再利用微生物采樣方法采集微生物培養(yǎng)[15～17]。由于微生物采樣具有耗時長、預警滯后、菌的存活率以及微生物泄露等問題，不太適用于實時預警儀器的評價。針對傳統(tǒng)方法的不足，新的評價技術也在不斷發(fā)展。相對細菌微生物，熒光聚苯乙烯微球具有粒徑可控，熒光性質穩(wěn)定，保存時間和溫度受外界條件影響小等特點，適用于生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率的評價。而且，針對生物氣溶膠設備方面的標準，僅有《顆粒生物氣溶膠采樣和分析通則》[18]對生物氣溶膠采樣方式進行了介紹和規(guī)范，國內現(xiàn)在還沒有針對該儀器的校準規(guī)范和檢定規(guī)程?；诖?，我們開展了針對生物氣溶膠監(jiān)測儀關鍵性能參數計數效率的評價研究，設計并搭建了1套生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價裝置，通過制備嚴格單分散熒光微球，結合文丘里霧化法發(fā)塵技術對生物氣溶膠監(jiān)測儀熒光通道和總粒子數2個通道的計數效率評價開展了相關研究。

2 生物氣溶膠監(jiān)測儀組成及原理

圖1 熒光法生物氣溶膠監(jiān)測儀原理圖Fig.1 Schematic of bioaerosol monitoring instrument based on fluorescence method

熒光法生物氣溶膠監(jiān)測儀是基于生物本征熒光的激光誘導熒光技術(laser induced fluorescence detection，LIF)，利用激光誘導生物性物質產生特定的熒光光譜，從而完成對生物氣溶膠的檢測和識別，主要包括激光光源系統(tǒng)、光路處理系統(tǒng)、光電轉換系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)。其中關鍵部件光路處理系統(tǒng)包括熒光通道和散射光通道(見圖1)。熒光通道是利用激光誘導生物性物質發(fā)出特定波段的熒光，然后通過光電轉換系統(tǒng)將熒光脈沖信號轉換為電信號進行熒光粒子計數。散射光通道是利用激光照射粒子發(fā)生散射，形成1個光脈沖信號，然后通過光電轉換系統(tǒng)轉換成電脈沖信號進行粒徑測量和總粒子計數。不是所有的分子都會發(fā)出熒光，而對于那些能夠發(fā)射熒光的分子，通常需要更高的激發(fā)頻率，當某些分子在躍遷的過程中被激發(fā)時便會產生熒光。生物物質中含有的氨基酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和核黃素等有機分子，可在紫外光的激發(fā)下，發(fā)射出本征熒光[19～21]。

3 實驗方法

3.1 熒光微球的制備

以水/乙醇為介質，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為穩(wěn)定劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，二乙烯基苯(DVB)為交聯(lián)劑，70 ℃反應16～24 h，制備得到單分散交聯(lián)聚苯乙烯微球(PS)。制備得到的聚苯乙烯微球通過SI-ATRP反應在PS微球表面修飾上熒光試劑得到熒光微球。具體制備過程如下：首先稱取干燥的PS微球1 g置于三口燒瓶中，加入15 mL二硫化碳溶脹過夜，加入100 mmol AlCl3和100 mmol二氯丁烷，快速攪拌，50 ℃反應4 h，反應結束后依次用乙醇、冰醋酸(3%)、水清洗微球，得到含氯修飾的微球。隨后配置反應液：0.01 mmol氯化亞銅，0.015 mmol多齒胺，2 mmol甲基丙烯酸縮水甘油酯和700 μL的乙醇渦旋混溶，并通入高純氮氣除去反應體系中的氧，取1 mL反應液到上述含氯修飾的聚苯乙烯微球中，一定溫度聚合2～16 h。最后加入羅丹明b酰肼，通過酰肼和甲基丙烯酸縮水甘油酯上的環(huán)氧基的縮合反應制備得到熒光聚苯乙烯微球，聚合后的熒光聚苯乙烯微球用乙醇、水洗3～10次，以除去未反應的單體和其他雜質。

3.2 生物氣溶膠計數效率評價

搭建的生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價裝置組成結構如圖2所示，由霧化發(fā)塵裝置、潔凈氣流、干燥箱和混勻艙組成。使用基于文丘里原理的霧化器，該霧化器是專門針對生物氣溶膠計數效率評價設計，只能發(fā)出粒徑小于等于3 μm的粒子，因此極大的減少了大粒徑粒子對計數結果的干擾。將聚苯乙烯微球或熒光微球混懸液從底部導入潔凈氣流霧化，下降過程中通過干燥氣體達到稀釋、干燥的目的，在混勻艙內形成濃度穩(wěn)定的氣溶膠。混勻艙中有兩路采樣口，分別放置生物氣溶膠監(jiān)測儀和空氣動力學粒徑譜儀。下方的空氣動力學粒徑譜儀(APS，model 3321，TSI公司，美國)也能夠測量顆粒物的數量和濃度，可對艙內的氣溶膠穩(wěn)定性進行實時監(jiān)控。

圖2 生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of counting efficiency of bioaerosol monitor evaluation system

評價時，通過調節(jié)真空泵的抽氣流量和超高效過濾器流量，使得生物氣溶膠采樣口和動力學粒徑譜儀采樣口的流量相同，從而提高測量結果的準確性。式(1)為計數效率的計算方法。采樣10 s后，通過將監(jiān)測儀計數的顆粒物數量濃度與空氣動力學粒徑譜儀數量濃度相比(10 s內累計熒光粒子個數)，通過計算可得出熒光粒子計數效率：

(1)

(3)投影分帶方法。UTM投影和高斯投影一樣為了減少投影變形進行分帶處理。UTM投影將北緯84°至南緯80°之間按經度分為60個帶，每帶6°，從西經180°自西向東分帶，兩條標準經線距中央經線為180 km左右。高斯投影從0°經線開始，采用經差6°(或3°)自西向東分帶。高斯投影的第1帶是UTM投影的第31帶。

4 結果和討論

4.1 熒光微球制備與表征

新型熒光聚苯乙烯微球的制備原理和流程如圖3所示，首先將引發(fā)劑二氯丁烷通過傅克烷基化連接在聚苯乙烯顆粒表面，之后與甲基丙烯酰胺羅丹明(GMA-Rb)單體進行ATRP聚合反應，在聚苯乙烯顆粒表面原位生長出熒光聚合物鏈。該方法制備是利用羅丹明B酰肼閉環(huán)無熒光，開環(huán)有熒光的“off-on”結構，制備得到了熒光聚合物-PS雜化熒光微球，它具有嚴格單分散和穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。熒光單體通過化學鍵鏈接，解決了物理吸附制備的熒光微球在霧化過程中易出現(xiàn)熒光試劑脫落問題。從電鏡照片可以看出，制備的PS-Rb微球球形均勻，粒徑單一(參見圖4右部)。而且采用的羅丹明b酰肼物質只有在酰肼和環(huán)氧基發(fā)生縮合開環(huán)反應后才有熒光，吸附上的羅丹明b酰肼試劑無熒光，這解決了有機熒光試劑在制備熒光聚苯乙烯微球時易產生物理吸附的問題。如圖5(a)所示，從羅丹明b酰肼和熒光單體GMA-Rb的熒光激發(fā)光譜可以看出，羅丹明b酰肼基本沒有熒光光譜峰，而GMA-Rb有明顯的激發(fā)峰，在550 nm有最大激發(fā)波長。從圖5(b)可以看出，在550 nm激發(fā)下，熒光微球PS-Rb在580 nm左右有最大發(fā)射波長。

圖3 熒光粒子制備過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the preparation of PS-Rb

圖4 電鏡圖PS微球和PS-Rb微球Fig.4 SEM images of the bare PS and PS-Rb

圖5 熒光光譜及熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Fluorescence spectrum and fluorescence microscope photos

4.2 單分散熒光氣溶膠

霧化發(fā)生器將熒光計數標準物質霧化后可得到粒徑已知、濃度穩(wěn)定的氣溶膠。但是實驗結果表明，商品化的熒光計數標準物質霧化以后存在大量的小粒徑非樣本顆粒，已超出生物氣溶膠監(jiān)測儀計數器的測量范圍。這不僅會對儀器造成污染和損害，無法獲得單分散氣溶膠樣品，還干擾了測量結果的準確性。推測造成這一現(xiàn)象的主要原因是熒光計數標準物質主要用于液體計數，溶液中含有大量的溶質，霧化過程中會將懸浮液中的部分溶質霧化干燥而形成非樣本顆粒(如表面活性劑顆粒、離子等)。

研究通過表面原子轉移自由基聚合法制備了用于霧化發(fā)塵的熒光微球，其熒光性質穩(wěn)定，粒徑均勻。該類熒光微球與溶液中的表面活性劑等溶質，在表面修飾過程中可得到很好的凈化，使得霧化過程中產生的非樣本顆粒數量減少，從而較為容易的得到單分散氣溶膠。

4.3 生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價

評價監(jiān)測儀計數效率前，需對計數效率評價系統(tǒng)進行穩(wěn)定性測試。為保證混勻艙內生物氣溶膠的濃度在一定時間內相對穩(wěn)定，對混勻艙中氣溶膠的穩(wěn)定性進行了測試，將稀釋流量設置為80 L/min、氣溶膠流量為3 L/min、抽氣流量為10 L/min。進行霧化法發(fā)塵5 min后，用動力學粒徑譜儀測量混勻艙內的氣溶膠濃度，為與生物氣溶膠監(jiān)測儀采集頻率保持一致，每10 s進行1次計數，每次采集10 s內總粒子數，2 min內總粒子數采集結果如圖6。

圖6 混勻艙內顆粒數量濃度的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of particle number concentration in the chamber

生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價系統(tǒng)能夠產生穩(wěn)定濃度的單分散氣溶膠粒子，對系統(tǒng)的穩(wěn)定性測試表明，在3 min內，系統(tǒng)霧化產生的氣溶膠粒子總粒子數的波動小于2%，滿足生物氣溶膠監(jiān)測儀的校準和總粒子數、熒光粒子數計數效率的評價需求。

通過霧化法將粒徑3 μm的PS微球和PS-Rb熒光微球形成單分散氣溶膠，待混勻艙內氣溶膠數量濃度穩(wěn)定后，開啟生物氣溶膠監(jiān)測儀和TSI空氣動力學粒徑譜儀進行采樣分析，計數結果如表1和表2所示。從表1和表2中可以得出，經過校準以后，霧化3 μm PS微球形成氣溶膠，總粒子通道平均計數效率可達100.7%，熒光粒子通道無計數。而3 μm PS-Rb微球霧化形成的氣溶膠，總粒子數和熒光粒子通道平均計數效率可達到98.9%和98.1%。這說明制備的熒光微球能夠形成單分散氣溶膠，可以同時滿足熒光法生物氣溶膠監(jiān)測儀≥0.5 μm的總粒子和熒光粒子2個通道的計數效率評價需求。

表1 3 μm PS計數結果Tab.1 Results as measured by 3 μm PS

表2 3 μm PS-Rb熒光微球計數結果Tab.2 Results as measured by 3 μm PS-Rb

5 結 論

針對生物氣溶膠監(jiān)測儀總粒子和熒光粒子2個通道的計數效率評價，利用SI-ATRP法制備了單分散、熒光性質穩(wěn)定的熒光聚苯乙烯微球。同時采用基于霧化發(fā)塵法搭建了1套生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率評價系統(tǒng)，并應用于生物氣溶膠監(jiān)測儀計數效率的評價，2個通道的平均計數效率分別達到98.9%和98.1%。實現(xiàn)了生物氣溶膠監(jiān)測儀總粒子數和熒光粒子數計數效率的校準與評價。該研究結果為進一步深入開展相關研究提供了基礎和依據。