不同粒度貓尾草對羔羊體外發(fā)酵特性和微生物數(shù)量的影響

王靜，孔令瑩，徐建風(fēng)，康靜，沈振峰，劉婷

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

貓尾草（Uraria crinita）為多年生禾本科牧草，因其葉量豐富、草質(zhì)細(xì)嫩、適口性好，常作為賽馬和兔子等觀賞動(dòng)物飼料的纖維來源［1］。奶牛采食貓尾草能增加逆嘔次數(shù)，延長產(chǎn)奶期，提高生產(chǎn)性能和產(chǎn)奶量［2-3］。但以貓尾草作為幼齡反芻動(dòng)物開食料纖維素來源的研究卻鮮有報(bào)道。中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）是評價(jià)粗飼料營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，其作用效果受到粒度、來源和水平等因素的影響［4-5］，其中，粗飼料粒度在促進(jìn)瘤胃發(fā)酵和維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要的作用［6-7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，粗飼料物理形態(tài)和粒度影響斷奶后幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系，但研究結(jié)果存在較大的差異［8］，這是不同粗飼料的物理和化學(xué)性質(zhì)差異所致?；诖耍角筘埼膊葸m宜粒度是利用其作為幼齡反芻動(dòng)物開食料纖維素來源的關(guān)鍵問題。本試驗(yàn)在相同營養(yǎng)水平基礎(chǔ)上，通過研究含有不同粒度貓尾草的全混合日糧（total mixed ration，TMR）對3 月齡羔羊體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃微生物菌群數(shù)量的影響，以期為貓尾草在幼齡反芻動(dòng)物開食料中的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

于2021年1 月，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)訓(xùn)教學(xué)中心開展試驗(yàn)。選擇3 只健康且體重相近［（13.42±0.73）kg］的3 月齡瘺管羊作為瘤胃液供體動(dòng)物，每天飼喂3 次，自由采食和飲水，保證羊舍衛(wèi)生干凈并定期消毒。貓尾草購自甘肅潤牧生物工程有限責(zé)任公司，帶回實(shí)驗(yàn)室測定初水分后，將其斬（碾）碎過篩，制備6 個(gè)不同粒度，分別為1.00、2.36、3.35、4.75、8.00 和12.50 mm。參照NRC［9］13 kg 綿羊羔羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制TMR 作為發(fā)酵底物（表1），其中貓尾草是試驗(yàn)飼料纖維素唯一來源。各處理組飼料除貓尾草粒度不同外，其他飼料原料粒度（0.425 mm）均保持一致。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)成分Table 1 Dietary composition and nutrient composition（dry matter basis）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素和雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照貓尾草的粒度將試驗(yàn)分為6 個(gè)處理組，分別為1.00 mm 組、2.36 mm 組、3.35 mm 組、4.75 mm 組、8.00 mm 組和12.50 mm 組。應(yīng)用Rusitec-s 人工瘤胃系統(tǒng)（Sanshin，東京，日本），將8 個(gè)發(fā)酵罐分為2 個(gè)處理，每個(gè)處理組4 個(gè)重復(fù)，每2 個(gè)處理組共同發(fā)酵48 h，在同等試驗(yàn)條件下共進(jìn)行3 批，進(jìn)行為期16 d 的試驗(yàn)，前10 d 為人工瘤胃系統(tǒng)穩(wěn)定期，后6 d 為正試期。

1.3 人工瘤胃培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 瘤胃液采集 晨飼前利用采集器收集試驗(yàn)羊瘤胃液，經(jīng)4 層細(xì)紗布過濾至已預(yù)熱［（39±0.5）℃］處理過的保溫桶內(nèi)，在此過程中持續(xù)通入CO2以保證厭氧環(huán)境，然后立即密封。與此同時(shí)，收集固體食糜后進(jìn)行保溫處理，帶回實(shí)驗(yàn)室置于（39±0.5）℃恒溫水浴箱中進(jìn)行分裝。

1.3.2 體外發(fā)酵培養(yǎng) 按照Mc Dougall［11］的方法配制人工瘤胃緩沖液。并在試驗(yàn)開始前置于水槽內(nèi)預(yù)熱至（39±0.5）℃，與瘤胃液按1∶1 分裝至發(fā)酵罐，并將裝有70 g 固體食糜的尼龍袋與10 g 樣品一并投入發(fā)酵罐內(nèi)。利用Rusitec-s 人工瘤胃系統(tǒng)，參照Kajikawa 等［12］的體外發(fā)酵方法進(jìn)行48 h 的體外發(fā)酵。其中，緩沖液流量為0.39 mL·min-1，流出液口篩網(wǎng)孔徑為1.2 mm，攪拌機(jī)攪拌頻率為4～5 次·min-1，發(fā)酵罐內(nèi)保持（39±0.5）℃和厭氧環(huán)境。

1.3.3 樣品采集與測定 分別在體外發(fā)酵3、6、9、12、24 和48 h 時(shí)，使用酸度計(jì)（PHS-3C，雷磁儀器廠，上海，中國）測定每個(gè)罐中發(fā)酵液pH。48 h 發(fā)酵結(jié)束后，收集各罐中發(fā)酵液和發(fā)酵殘?jiān)糜跍y定發(fā)酵參數(shù)和瘤胃微生物菌群數(shù)量。采集發(fā)酵液5 mL 至液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存在-70 ℃冰箱，用于測定瘤胃微生物菌群的數(shù)量。另外，采集2 mL 發(fā)酵液，4 ℃、12000 r·min-1離 心10 min 取 上 清 液1 mL 于2 mL 離心管內(nèi)，-20 ℃保存，用于發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）和 氨 態(tài) 氮（ammonia nitrogen，NH3-N）濃度的測定。參照馮宗慈等［13］的方法測定NH3-N 濃度。參照鄭琛等［14］的方法使用氣相色譜儀（6890N，Agilent，美國）測定VFA，色譜柱為HP 19091N-213 毛細(xì)管柱。色譜分析條件為：進(jìn)樣口溫度220 ℃，N2流量2.0 mL·min-1，分流比40∶1，程序升溫模式為120 ℃保持3 min，然后10 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持1 min，火焰氫離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）250 ℃，F(xiàn)ID 空氣、H2和N2流量分別為450、40 和45 mL·min-1［15］。

收集發(fā)酵殘?jiān)娓珊螅謩e按照Cunniff［16］和Van Soest 等［17］的方法測定干物質(zhì)（dry matter，DM）、粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量，并計(jì)算發(fā)酵底物中各營養(yǎng)成分的體外降解率，計(jì)算公式如下：

1.4 微生物菌群數(shù)量的測定

參照Yuan 等［18］的方法提取發(fā)酵液微生物總DNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDropTMOne，美國）測定發(fā)酵液微生物總DNA 吸光度（OD），OD260/OD280均為1.8～2.0，可進(jìn)行下一步分析。按照SYBRGreenⅡ預(yù)混試劑盒建議的20 μL 反應(yīng)體系，使用實(shí)時(shí)定量PCR 對發(fā)酵內(nèi)容物總菌（total bacteria，TB）、溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens，B.f）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes，F(xiàn).s）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus，R.a）、總產(chǎn)甲烷菌（totalMethanogens，TMe）和甲烷桿菌（Methanobacteriaceae，Mba）進(jìn)行測定。目的微生物的數(shù)量分別以16S rRNA 或18S rRNA 基因拷貝數(shù)（拷貝數(shù)·mL-1）表示，引物序列見表2。

表2 瘤胃微生物引物序列Table 2 Rumen microbial primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 21.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，48 h 養(yǎng)分降解率、發(fā)酵液參數(shù)和微生物絕對數(shù)量用單因素方差分析，發(fā)酵液動(dòng)態(tài)pH 值用雙因素方差分析，差異顯著時(shí)采用Tukey 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粒度貓尾草對體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

由表3 可知，體外干物質(zhì)降解率（in vitrodry matter degradability，IVDMD）隨著貓尾草粒度的增加而降低，其中4.75 和12.50 mm 組 顯 著 低于1.00 mm 組（P＜0.05）；而 體 外 粗 蛋 白 質(zhì) 降 解 率（in vitrocrude protein degradability，IVCPD）隨著貓尾草粒度的增加而升高，其中，12.50 mm 組顯著高于1.00、2.36 和3.35 mm 組（P＜0.05）；體外中性洗滌纖維降解率（in vitroneutral detergent fiber degradability，IVNDFD）隨著貓尾草粒度的增加而逐漸降低，其中，1.00 和2.36 mm 組顯著高于8.00 和12.50 mm 組（P＜0.05）。而體外酸性洗滌纖維降解率（in vitroacid detergent fiber degradability，IVADFD）在各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同粒度貓尾草48 h 體外發(fā)酵對養(yǎng)分降解率的影響Table 3 Effects of fermentation in vitro for 48 h on nutrient degradability of U.crinita with different particle sizes（%）

2.2 不同粒度貓尾草對體外發(fā)酵液參數(shù)的影響

由表4 可知，不同粒度貓尾草經(jīng)48 h 體外發(fā)酵在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH 值均無顯著差異（P＞0.05），但都呈先降低后升高的趨勢，且時(shí)間和粒度間無顯著的交互作用（P＞0.05）。

表4 不同粒度貓尾草體外發(fā)酵動(dòng)態(tài)pH 值Table 4 Dynamic pH value in vitro fermentation of U.crinita with different particle sizes

由表5 可知，NH3-N 濃度和總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）隨著貓尾草粒度的增加呈先降低后升高的趨勢，其中，12.50 mm 組顯著高于3.35 和4.75 mm 組（P＜0.05）；丙酸摩爾比也隨著貓尾草粒度的增加呈先降低后升高的趨勢，其中，1.00 mm 組顯著高于4.75 mm 組（P＜0.05）；而1.00 mm 組異丁酸和丁酸摩爾比顯著低于8.00 和2.36 mm 組（P＜0.05），異戊酸和戊酸摩爾比顯著低于2.36 mm 組（P＜0.05）；乙酸摩爾比和乙酸/丙酸在各處理組間無顯著差異（P＞0.05）。

表5 不同粒度貓尾草對48 h 體外發(fā)酵液參數(shù)的影響Table 5 Effects of different particle sizes of U.crinita on parameters of fermentation broth in vitro for 48 h

2.3 不同粒度貓尾草對發(fā)酵液微生物絕對數(shù)量的影響

由表6 可知，隨著貓尾草粒度的增加，B.f 和Mba 的數(shù)量呈先升高后降低再升高的趨勢，其中，2.36 mm 組B.f顯著高于3.35 和4.75 mm 組（P＜0.05），Mba 顯著高于3.35、4.75 和8.00 mm 組（P＜0.05）。TMe 數(shù)量隨著貓尾草粒度的增加先降低后增加，其中，4.75、8.00 和12.50 mm 組顯著高于1.00 和2.36 mm 組（P＜0.05），TB、F.s 和R.a 在各處理組間無顯著差異（P＞0.05）。

表6 不同粒度貓尾草對48 h 發(fā)酵液微生物絕對數(shù)量的影響Table 6 Effects of different particle sizes of U. crinita on the absolute number of microorganisms in fermentation broth for 48 h［log10（copies·mL-1）］

2.4 體外瘤胃發(fā)酵特征與微生物相關(guān)性分析

由表7 可知，TB 與NH3-N 和乙酸呈正相關(guān)（R2=0.84，P=0.038；R2=0.88，P=0.021）；B.f 與丙酸呈正相關(guān)（R2=0.82，P=0.045），與pH 呈 負(fù) 相 關(guān)（R2=-0.98，P=0.001）；TMe 與IVCPD 呈 正 相 關(guān)（R2=0.91，P=0.012），與IVDMD 和IVNDFD 呈負(fù)相關(guān)（R2=-0.86，P=0.027；R2=-0.83，P=0.043）；Mba 與pH 呈負(fù)相關(guān)（R2=-0.90，P=0.015）。

表7 瘤胃發(fā)酵特性與微生物相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of rumen fermentation characteristics and microorganisms

3 討論

3.1 不同粒度貓尾草對體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

瘤胃內(nèi)干物質(zhì)降解率是影響反芻動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)降解與發(fā)酵的重要因素［24］。本試驗(yàn)中，IVDMD 和IVNDFD 隨著貓尾草粒度的增加而降低，與多項(xiàng)研究結(jié)果一致，如Zhao 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在裝有瘤胃瘺管的肉牛日糧中含加工的大麥（Hordeum vulgare）籽粒粉碎比例越高，原位降解率越高；Ueda 等［26］發(fā)現(xiàn)，隨著飼料顆粒尺寸的減小，會增加顆粒與瘤胃微生物的接觸面積，結(jié)構(gòu)型碳水化合物更容易被降解，從而提高瘤胃IVDMD 和IVNDFD。本試驗(yàn)IVCPD 隨著貓尾草粒度的增加而升高，其中，12.50 mm 組顯著高于1.00、2.36 和3.35 mm組，然而韓海珠等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在人工瘤胃試驗(yàn)中大顆粒組（5 mm）日糧IVCPD 大于小顆粒組（0.45 mm），本試驗(yàn)結(jié)果與此相反，可能是長粒度貓尾草在瘤胃內(nèi)的流通速率慢，能夠充分促進(jìn)養(yǎng)分消化，因此IVCPD 隨著貓尾草粒度的增加而升高。此外，因試驗(yàn)所用尼龍袋孔徑為0.045 mm，發(fā)酵液流出時(shí)過濾網(wǎng)的孔徑為1.2 mm，1.00 mm 粒度組在微生物降解過程中許多小顆粒會隨著發(fā)酵液流出，可能導(dǎo)致發(fā)酵參數(shù)有誤。

3.2 不同粒度貓尾草對體外發(fā)酵液參數(shù)的影響

pH 是評價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，它決定著瘤胃微生物對飼糧的發(fā)酵和利用情況［28］。本試驗(yàn)中，不同粒度貓尾草經(jīng)48 h 發(fā)酵后的pH 無顯著差異，但呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。各粒度貓尾草發(fā)酵后的pH 值為5.70～5.94，均處于正常范圍值內(nèi)（5.5～7.5）［29］，且整體偏低，這有利于微生物發(fā)酵。pH 值偏低可能與低纖維水平（10% FNDF）飼糧中非纖維性碳水化合物含量較高有關(guān)，加之貓尾草木質(zhì)化程度較低，可降解的纖維含量較高，進(jìn)入瘤胃后能被微生物快速降解，導(dǎo)致TVFA 迅速增加引起pH 值降低。曾銀等［30］研究表明，飼料粒度與瘤胃pH 值的關(guān)系存在一個(gè)臨界粉碎粒度，當(dāng)粗飼料粒度范圍在某臨界值以下，會對瘤胃pH 值水平造成影響。周萬才等［31］研究報(bào)道，在自由采食條件下，直徑為3 mm 的顆粒料可以提高肉牛瘤胃發(fā)酵速度，降低瘤胃pH 值，當(dāng)顆粒直徑提高至8 mm 時(shí)，可以降低瘤胃發(fā)酵速度。而Kononoff 等［32］和Yang 等［33］的研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH 值并未受到玉米（Zea mays）青貯顆粒長短的影響。以上試驗(yàn)結(jié)論的差異可能是因?yàn)轱暭Z顆粒大小存在臨界值造成的。

NH3-N 是瘤胃中粗蛋白質(zhì)降解的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的來源，可以反映瘤胃中含氮物質(zhì)的供應(yīng)和利用情況［34］。本試驗(yàn)中4.75 mm 組NH3-N 濃度顯著低于12.50 mm 組，Hildebrand 等［35］也報(bào)道了大顆粒組（4 mm）NH3-N 濃度顯著高于小顆粒組（1 mm），本試驗(yàn)結(jié)果與此一致。李杰等［36］研究表明，飼喂較大顆粒（2.5～5.0 mm）的豆粕會降低瘤胃外流速度。因而12.50 mm 的貓尾草在瘤胃中停留時(shí)間長，致使微生物的分解時(shí)間增加，由此提高了NH3-N 濃度。

VFA 是碳水化合物發(fā)酵的最終產(chǎn)物，其含量及組成比例是反映瘤胃消化代謝活動(dòng)的重要指標(biāo)［37］。本試驗(yàn)中，當(dāng)貓尾草粒度增加到12.50 mm 時(shí)，TVFA 含量顯著升高，乙酸摩爾比和乙酸/丙酸值也最大。Rodriguez-Prado 等［38］和Hildebrand 等［35］研究表明，大顆粒組（分別為3 和4 mm）TVFA、乙酸和乙酸/丙酸均高于小顆粒組（1 mm），本試驗(yàn)結(jié)果與此相一致。Benchaar 等［39］和Abderzak 等［40］認(rèn)為，NDF 水平低的日糧可以提高淀粉分解菌的活性從而促進(jìn)丙酸和丁酸的合成。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，粒度為1.00 mm 時(shí)顯著提高了丙酸摩爾比，粒度為2.36 mm 時(shí)顯著提高了異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸摩爾比和IVNDFD。這說明在低NDF 水平下隨著貓尾草粒度的減小，提高了淀粉在瘤胃中的消化率和IVNDFD［33，41］，進(jìn)而增加了其降解產(chǎn)物丙酸和丁酸的產(chǎn)生。王加啟等［42］報(bào)道，飼糧組成、碳水化合物的來源及加工處理技術(shù)和瘤胃環(huán)境是影響瘤胃發(fā)酵與VFA 產(chǎn)生量和比例的因素。本試驗(yàn)中各組飼糧組成和碳水化合物來源均相同，VFA 含量及其比例是受到飼料加工處理和瘤胃環(huán)境的影響。

3.3 體外瘤胃發(fā)酵特征與微生物相關(guān)性分析

瘤胃細(xì)菌附著于飼料顆粒表面，通過侵蝕方式逐漸降解植物細(xì)胞壁［43］，且能分泌纖維素酶和蛋白酶等消化酶［44］，由多種細(xì)菌和酶相互協(xié)同作用才能使結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維降解［45］，最終產(chǎn)生可用于生長和維持的終產(chǎn)品使宿主受益，因此瘤胃微生物對宿主的生存至關(guān)重要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，B.f 與丙酸摩爾比呈正相關(guān)，與pH 值呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)粒度為2.36 mm 時(shí)，B.f 數(shù)量和IVNDFD 都顯著升高，丙酸摩爾比也相對較高，而48 h 時(shí)pH 值相對較低。這表明羔羊瘤胃內(nèi)B.f 降解纖維素的能力在粒度為2.36 mm 時(shí)最強(qiáng)，發(fā)酵程度較好導(dǎo)致pH 下降［31］。Mba 與pH呈負(fù)相關(guān)，TB 與乙酸摩爾比呈正相關(guān)；當(dāng)粒度為4.75 mm 時(shí)，48 h 的pH 值最高，TVFA 和Mba 數(shù)量顯著降低，乙酸摩爾比和TB 數(shù)量也最低。此結(jié)果表明，粒度為4.75 mm 時(shí)瘤胃內(nèi)發(fā)酵程度較低，TVFA 含量低，pH 值上升，幼齡動(dòng)物對乙酸的利用率隨著產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的減少而降低。許多瘤胃細(xì)菌代謝產(chǎn)生乙酸，生長也需要乙酸［46］，成艷芬等［47］研究表明，產(chǎn)甲烷菌可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物乙酸生成甲烷，從而降低動(dòng)物體對乙酸的利用率。本試驗(yàn)中，TB 與NH3-N 濃度呈正相關(guān)，TMe 與IVCPD 呈正相關(guān)，這說明隨著瘤胃內(nèi)發(fā)酵程度的提高，蛋白質(zhì)降解度增加，NH3-N 濃度也相應(yīng)升高，為瘤胃微生物提供了豐富的氮源，從而增加了TB 數(shù)量，提高了產(chǎn)甲烷菌對氮的利用率。研究表明，飼料粒度影響通過瘤胃的食糜大小和在瘤胃內(nèi)的停滯時(shí)間，從而影響瘤胃微生物的活性［48］。然而，目前不同粒度對低纖維水平飼料發(fā)酵特性和瘤胃微生物的影響還存在很大的爭議，且體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也存在差異，確定不同粒度貓尾草對瘤胃微生物-宿主的互作關(guān)系需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

低纖維水平飼料中不同粒度的貓尾草能夠調(diào)控發(fā)酵液中微生物數(shù)量，改變其發(fā)酵特征從而影響飼料的體外降解率；瘤胃微生物數(shù)量與VFA 和養(yǎng)分降解率存在一定的相關(guān)性，這種相互作用對幼齡動(dòng)物的生長發(fā)育有一定的作用。